【摘 要】
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黄酮类化合物是植物中的一类次生代谢产物,具有多种生物活性,在食品、药品、化妆品等领域都有重要应用。目前大多数黄酮类化合物的获取方式仍大多依赖植物提取法。使用微生物合成法合成天然产物相比于植物提取法具有反应条件更温和、安全性高、可再生性强、对环境友好等优势。本研究从异源酶的泛素化修饰角度出发,在酿酒酵母中建立了异源酶泛素化水平检测系统,并对从柚皮素到二氢槲皮素的合成途径进行了表达强化,实现了二氢槲皮
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黄酮类化合物是植物中的一类次生代谢产物,具有多种生物活性,在食品、药品、化妆品等领域都有重要应用。目前大多数黄酮类化合物的获取方式仍大多依赖植物提取法。使用微生物合成法合成天然产物相比于植物提取法具有反应条件更温和、安全性高、可再生性强、对环境友好等优势。本研究从异源酶的泛素化修饰角度出发,在酿酒酵母中建立了异源酶泛素化水平检测系统,并对从柚皮素到二氢槲皮素的合成途径进行了表达强化,实现了二氢槲皮素的异源合成。具体工作内容如下:（1）在酿酒酵母中构建泛素化水平的实时原位检测体系。利用酿酒酵母作为平台菌株,合成包括黄酮化合物在内的众多高价值天然产物涉及多种异源酶的表达。经过泛素化修饰的蛋白质经由泛素-蛋白酶体系统降解,这一过程对维持细胞正常生理活动具有重要意义,对异源蛋白的表达和积累也可能具有显著影响。本文利用荧光双分子互补法在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中建立了泛素化修饰的实时原位检测体系,以荧光强度表征异源蛋白的泛素化修饰水平。以柚皮素生物合成途径相关酶为例,获得了荧光值下降即泛素化水平下降的突变体。（2）利用生物信息工具预测柚皮素合成相关蛋白潜在泛素化位点并将该位点由赖氨酸突变为精氨酸,用于降低异源蛋白的泛素化修饰水平。其中,酪氨酸解氨酶Fj TAL、查尔酮合成酶Sj CHS、Sm CHS突变体表现为荧光下降,表明其泛素化水平有所降低。发酵结果进一步证实,酪氨酸解氨酶Fj TAL突变体Fj TALK487R在酿酒酵母中催化生产对香豆酸更具优势,相较原始Fj TAL对香豆酸产量提高了32.3%,而表达查尔酮合成酶突变体的酿酒酵母产量没有明显变化。对柚皮素生物合成途径相关蛋白的潜在泛素化位点进行突变,能够提高对香豆酸产量,对柚皮素生物合成具有积极影响。（3）进一步从柚皮素出发合成二氢槲皮素。通过强化F3’H和CPR的适配性得到了最佳组合即Sm F3’H和Sc CPR,使圣草酚积累量提高到了435.7 mg·L-1。通过生物信息工具预测Sm F3’H潜在的泛素化修饰位点并构建相应的突变体,经过发酵验证获得了优势突变体Sm F3’HK290R,进一步提高了圣草酚的积累量。对Sm F3’H和Sc CPR的跨膜结构的功能进行了初步探索,结果表明Sm F3’H的跨膜结构对其功能具有重要影响。筛选得到了催化效率更高的Cs F3H,并应用启动子工程优化其表达水平,在以柚皮素为底物发酵72 h后获得了381.2 mg·L-1的二氢槲皮素。
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