论文部分内容阅读
第一部分是利福霉素生物合成基因簇内部TetR家族调控蛋白RifQ的功能鉴定。利福霉素是由地中海拟无分枝菌合成的临床用抗生素，其在对抗结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌感染发挥重要作用。生物信息学分析显示，利福霉素生物合成基因簇内存在TetR家族调控蛋白rifQ，其位于利福霉素泵出蛋白rifP的下游。通过EMSA、DNaseⅠ足迹实验以及体内的RT-PCR实验证明RifQ直接负调控利福霉素泵出蛋白rifP的转录，并在其DNaseⅠ酶切的保护区中找到经典反向重复序列CTTATANNNNNTATAAG。RifQ的调控功能受到利福霉素B的反馈调节:利福霉素B可以使RifQ失去与rifP启动子的结合能力，从而间接调控rifP的转录。除了调控泵出蛋白rifP的转录，RifQ还参与对数生长前期和中期正调控利福霉素基因簇的转录和正调控糖异生途径关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的转录。此外，本研究还证明RifQ含有两个helix-turn-helix(HTH)结构域，其中N端HTH结构域负责DNA结合，而C端HTH结构域则与RifQ多聚体形态相关。RifQ协同调控利福霉素的泵出与合成过程，从而调控利福霉素在胞内的浓度以及生物合成。RifQ还参与糖异生过程的调控，猜测这可能是地中海拟无分枝菌通过调控利福霉素合成前体从而调控利福霉素合成的另一途径，这也是首次证明TetR家族调控蛋白参与糖异生途径调控。 第二部分是利福霉素生物合成基因簇内部转酮酶Rif15的催化机理的解析。利福霉素生物合成基因簇内转酮酶rif15以及其下游细胞色素P450 rif16是利福霉素SV到B合成过程中的关键基因，然而它们并不能独立完成利福霉素SV到B的转化。通过体外的生化实验表明，异源表达的Rif15可以以利福霉素S为受体底物，并以木酮糖五磷酸、核糖五磷酸、核酮糖五磷酸、葡萄糖六磷酸等磷酸糖作为供体底物生成新的利福霉素衍生物，其中木酮糖五磷酸为最适供体底物。通过高效液相色谱、此外可见光谱、高分辨质谱、核磁共振(NMR)等分析方法推测其产物的可能结构为利福霉素L。Rif15催化的反应严格依赖于硫铵素焦磷酸(TPP)与二价阳离子，其中Mn2+为最适二价阳离子。本研究还证明Rif16可以通过相互作用的方式促进Rif15的催化活力。相比于初级代谢中转酮酶，Rif15催化独特的受体底物利福霉素S，并且很可能催化生成C-O键，这与经典转酮酶完全不一样，是一个全新的催化机制。通过信息学分析表明，类似Rif15的这种两亚基转酮酶在放线菌中普遍存在，暗示这种新的催化机制可能在放线菌中普遍存在，而不是利福霉素生物合成过程中所独有的催化反应。