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本文主要从以下几个部分展开论述：
第一部分 NLRC3在脓毒症小鼠巨噬细胞中的表达及与其免疫麻痹关系
目的：观察NLRC3在脓毒症小鼠巨噬细胞中的表达及与其免疫麻痹的关系。
方法：采用雄性C57BL/6J小鼠建立重度盲肠结扎穿孔（CLP）模型（暴露盲肠后用4-0丝线距回盲瓣1/3处结扎，20G穿刺针在结扎远端穿孔2次，并挤出少量粪便以保证穿孔的通畅）复制脓毒症动物模型，Sham组仅做暴露不做穿孔，术后48h，首先，将存活小鼠随机分为Sham、Sham+PA、CLP与CLP+PA组，Sham+PA与CLP+PA组小鼠经气管滴注1×107CFU铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa,PA）进行“二次”打击，Sham与CLP组滴注相应体积的PBS，观察小鼠10天生存率及检测PA处理后24h各组外周血与肺匀浆中的细菌负荷；其次，提取CLP与Sham术后0h、24h、48h与3d的肺泡与腹腔巨噬细胞，随机分为Sham、Sham+HK-PA和CLP+HK-PA组，给予1×106CFU/mL热灭活的铜绿假单胞菌（heat-killed P.Aeruginosa，HK-PA）或对照试剂进行“二次”刺激，Real-time PCR检测各组细胞TNF-αmRNA的表达；同时，提取Sham与CLP术后0h、6h、12h、24h、48h、3d、4d与5d各组的肺泡与腹腔巨噬细胞，Real-time PCR检测NLRC3mRNA表达；并且，提取CLP与Sham术后48h小鼠腹腔巨噬细胞，随机分为Sham、Sham+HK-PA、CLP和CLP+HK-PA组，体外给予各组细胞1×106CFU/ml HK-PA或对照试剂进行“二次”刺激，western blotting检测细胞NLRC3蛋白的表达，最后，分别用空载体（Null Vector）、NLRC3过表达或shNLRC3慢病毒载体，构建NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7细胞系，将细胞随机分为：Null VectorNaive、Null VectorTolerant、NLRC3Naive、NLRC3Tolerant、shNLRC3Naive与shNLRC3Tolerant组；其中，Null VectorTolerant、NLRC3Tolerant与shNLRC3Tolerant组细胞，先用100ng/mL LPS刺激24h诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”；然后再用LPS进行“二次”刺激，Null VectorNaive、NLRC3Naive与shNLRC3Naive组在开始用LPS诱导耐受的时间点，先用相应培养基处理24h，接着再给予LPS刺激；分别用Real-time PCR和ELISA试剂盒检测“二次”刺激后各组TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。
结果：Sham和CLP术后48h存活小鼠遭受PA“二次”打击时，Sham+PA组小鼠生存率不受影响，相对于Sham+PA组，CLP+PA组小鼠死亡率显著增加（P<0.05）。同时，Sham和CLP后24h、48h和72h时提取的腹腔与肺泡巨噬细胞，在体外遭受HK-PA刺激时，相对于Sham+HK-PA组，CLP+HK-PA组TNF-α表达量显著降低（P<0.05）。CLP后小鼠肺泡与腹腔巨噬细胞中的NLRC3mRNA表达呈现出先降低后增高的趋势，其中6h时显著降低（P<0.05），24h、48h和72h显著升高（P<0.05），差异具有统计学意义。相对于Sham组，CLP48h时，腹腔巨噬细胞NLRC3蛋白表达显著增加（P<0.05）；当细胞遭受再次刺激时，与Sham+HK-PA组相比，CLP+HK-PA组NLRC3蛋白表达显著升高（P<0.05）。NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7细胞免疫麻痹后，在LPS“二次”刺激时，与Null VectorTolerant和NLRC3Tolerant组相比，shNLRC3Tolerant组TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。
结论：NLRC3在脓毒症小鼠巨噬细胞中，呈现先降低后增加的变化特征，沉默巨噬细胞NLRC3表达可改善免疫麻痹细胞免疫炎症反应，这可能与脓毒症免疫麻痹的发生有关。
第二部分 NLRC3在脓毒症免疫麻痹中对小鼠巨噬细胞糖酵解活性的影响
目的：探讨NLRC3是否与脓毒症免疫麻痹小鼠巨噬细胞有氧糖酵解（Warburg效应）紊乱有关。
方法：将C57BL/6J小鼠随机分为Sham组和CLP组；Real-time PCR检测Sham或CLP术后6h（6h-CLP）与48h（48h-CLP）腹腔巨噬细胞糖酵解关键激酶：葡萄糖转运体1（GLUT1）、己糖激酶2（hexokinase2,HK2）、6-磷酸果糖激酶-1（Phosphofructokinase1,PFK1）、烯醇化酶（enolase2）、磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphateisomerase，TPI）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、6-磷酸果糖激酶2/果糖2，6二磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase3,PFKFB3）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）mRNA表达；取CLP与Sham术后48h腹腔或肺泡巨噬细胞，随机分为Sham、Sham+HK-PA、CLP和CLP+HK-PA组；体外给予各组1×106CFU/ml HK-PA或对照试剂进行“二次”刺激，Real-time PCR检测腹腔巨噬细胞上述糖酵解关键激酶mRNA表达，乳酸检测试剂盒检测肺泡与腹腔巨噬细胞上清液中乳酸的量；分别用空载体（Null Vector）、NLRC3过表达或shNLRC3慢病毒载体，构建NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7细胞系，将细胞随机分为：Null VectorNaive、Null VectorTolerant、NLRC3Naive、NLRC3Tolerant、shNLRC3Naive与shNLRC3Tolerant组；其中，Null VectorTolerant、NLRC3Tolerant与shNLRC3Tolerant组细胞，先用100ng/mL LPS刺激24h诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”，然后再用LPS进行“二次”刺激，Null VectorNaive、NLRC3Naive与shNLRC3Naive组在开始用LPS诱导耐受的时间点，先用相应培养基预处理24h，接着再给予LPS刺激，Real-time PCR检测“二次”刺激后各组细胞GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达，Seahorse XFe24生物能分析仪检测各组的细胞外酸化率（ECAR）变化；乳酸检测试剂盒检测上清液中乳酸的变化；分别用空载体（Null Vector）、NLRC3过表达、shNLRC3慢病毒载体转染骨髓来源巨噬细胞（BMDM），将细胞随机分为：Null VectorNaive、Null VectorTolerant、NLRC3Naive、NLRC3Tolerant、shNLRC3Naive与shNLRC3Tolerant组；其中，Null VectorTolerant、NLRC3Tolerant与shNLRC3Tolerant组细胞，先用100ng/mL LPS刺激24h诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”，然后再用LPS进行“二次”刺激；Null VectorNaive、NLRC3Naive与shNLRC3Naive组在开始用LPS诱导耐受的时间点，先用RIPM1640培养基预处理24h，接着再给予LPS刺激；Real-time PCR检测各组细胞GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达，乳酸检测试剂盒检测细胞上清液中乳酸变化；
结果：与Sham组相比，CLP后6h腹腔巨噬细胞GLUT1、HK2、PFK1、PFKFB3和LDHA mRNA表达显著增加，与6h-CLP组相比，48h-CLP组腹腔巨噬细胞GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达显著降低；与Sham组相比，Sham+HK-PA组腹腔巨噬细胞中GLUT1、HK2、PFKFB3、PFK1、Enolase2、GAPDH、TPI、enolase2和LDHA mRNA表达量显著增加（P<0.05），腹腔与肺泡巨噬细胞细胞上清液中乳酸含量显著增加（P<0.05）；与Sham+HK-PA组相比，CLP+HK-PA组GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达量及乳酸含量显著降低（P<0.05）；NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7耐受细胞，在LPS“二次”刺激时，与Null VectorTolerant和NLRC3Tolerant组相比，shNLRC3Tolerant组细胞的GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达、基础糖酵解率、糖酵解率、最大糖酵解率及储备糖酵解率，以及细胞上清液中乳酸含量显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。
结论：NLRC3表达与脓毒症免疫麻痹小鼠的巨噬细胞有氧糖酵解紊乱有关，沉默NLRC3表达可增强免疫麻痹巨噬细胞有氧糖酵解。
第一部分 NLRC3在脓毒症小鼠巨噬细胞中的表达及与其免疫麻痹关系
目的：观察NLRC3在脓毒症小鼠巨噬细胞中的表达及与其免疫麻痹的关系。
方法：采用雄性C57BL/6J小鼠建立重度盲肠结扎穿孔（CLP）模型（暴露盲肠后用4-0丝线距回盲瓣1/3处结扎，20G穿刺针在结扎远端穿孔2次，并挤出少量粪便以保证穿孔的通畅）复制脓毒症动物模型，Sham组仅做暴露不做穿孔，术后48h，首先，将存活小鼠随机分为Sham、Sham+PA、CLP与CLP+PA组，Sham+PA与CLP+PA组小鼠经气管滴注1×107CFU铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa,PA）进行“二次”打击，Sham与CLP组滴注相应体积的PBS，观察小鼠10天生存率及检测PA处理后24h各组外周血与肺匀浆中的细菌负荷；其次，提取CLP与Sham术后0h、24h、48h与3d的肺泡与腹腔巨噬细胞，随机分为Sham、Sham+HK-PA和CLP+HK-PA组，给予1×106CFU/mL热灭活的铜绿假单胞菌（heat-killed P.Aeruginosa，HK-PA）或对照试剂进行“二次”刺激，Real-time PCR检测各组细胞TNF-αmRNA的表达；同时，提取Sham与CLP术后0h、6h、12h、24h、48h、3d、4d与5d各组的肺泡与腹腔巨噬细胞，Real-time PCR检测NLRC3mRNA表达；并且，提取CLP与Sham术后48h小鼠腹腔巨噬细胞，随机分为Sham、Sham+HK-PA、CLP和CLP+HK-PA组，体外给予各组细胞1×106CFU/ml HK-PA或对照试剂进行“二次”刺激，western blotting检测细胞NLRC3蛋白的表达，最后，分别用空载体（Null Vector）、NLRC3过表达或shNLRC3慢病毒载体，构建NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7细胞系，将细胞随机分为：Null VectorNaive、Null VectorTolerant、NLRC3Naive、NLRC3Tolerant、shNLRC3Naive与shNLRC3Tolerant组；其中，Null VectorTolerant、NLRC3Tolerant与shNLRC3Tolerant组细胞，先用100ng/mL LPS刺激24h诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”；然后再用LPS进行“二次”刺激，Null VectorNaive、NLRC3Naive与shNLRC3Naive组在开始用LPS诱导耐受的时间点，先用相应培养基处理24h，接着再给予LPS刺激；分别用Real-time PCR和ELISA试剂盒检测“二次”刺激后各组TNF-α、IL-1β和IL-6表达水平。
结果：Sham和CLP术后48h存活小鼠遭受PA“二次”打击时，Sham+PA组小鼠生存率不受影响，相对于Sham+PA组，CLP+PA组小鼠死亡率显著增加（P<0.05）。同时，Sham和CLP后24h、48h和72h时提取的腹腔与肺泡巨噬细胞，在体外遭受HK-PA刺激时，相对于Sham+HK-PA组，CLP+HK-PA组TNF-α表达量显著降低（P<0.05）。CLP后小鼠肺泡与腹腔巨噬细胞中的NLRC3mRNA表达呈现出先降低后增高的趋势，其中6h时显著降低（P<0.05），24h、48h和72h显著升高（P<0.05），差异具有统计学意义。相对于Sham组，CLP48h时，腹腔巨噬细胞NLRC3蛋白表达显著增加（P<0.05）；当细胞遭受再次刺激时，与Sham+HK-PA组相比，CLP+HK-PA组NLRC3蛋白表达显著升高（P<0.05）。NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7细胞免疫麻痹后，在LPS“二次”刺激时，与Null VectorTolerant和NLRC3Tolerant组相比，shNLRC3Tolerant组TNF-α、IL-1β和IL-6水平显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。
结论：NLRC3在脓毒症小鼠巨噬细胞中，呈现先降低后增加的变化特征，沉默巨噬细胞NLRC3表达可改善免疫麻痹细胞免疫炎症反应，这可能与脓毒症免疫麻痹的发生有关。
第二部分 NLRC3在脓毒症免疫麻痹中对小鼠巨噬细胞糖酵解活性的影响
目的：探讨NLRC3是否与脓毒症免疫麻痹小鼠巨噬细胞有氧糖酵解（Warburg效应）紊乱有关。
方法：将C57BL/6J小鼠随机分为Sham组和CLP组；Real-time PCR检测Sham或CLP术后6h（6h-CLP）与48h（48h-CLP）腹腔巨噬细胞糖酵解关键激酶：葡萄糖转运体1（GLUT1）、己糖激酶2（hexokinase2,HK2）、6-磷酸果糖激酶-1（Phosphofructokinase1,PFK1）、烯醇化酶（enolase2）、磷酸丙糖异构酶（Triose-phosphateisomerase，TPI）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）、6-磷酸果糖激酶2/果糖2，6二磷酸酶3（6-phosphofructo-2-kinase/fructose-2,6-bisphosphatase3,PFKFB3）和乳酸脱氢酶A（lactate dehydrogenase A，LDHA）mRNA表达；取CLP与Sham术后48h腹腔或肺泡巨噬细胞，随机分为Sham、Sham+HK-PA、CLP和CLP+HK-PA组；体外给予各组1×106CFU/ml HK-PA或对照试剂进行“二次”刺激，Real-time PCR检测腹腔巨噬细胞上述糖酵解关键激酶mRNA表达，乳酸检测试剂盒检测肺泡与腹腔巨噬细胞上清液中乳酸的量；分别用空载体（Null Vector）、NLRC3过表达或shNLRC3慢病毒载体，构建NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7细胞系，将细胞随机分为：Null VectorNaive、Null VectorTolerant、NLRC3Naive、NLRC3Tolerant、shNLRC3Naive与shNLRC3Tolerant组；其中，Null VectorTolerant、NLRC3Tolerant与shNLRC3Tolerant组细胞，先用100ng/mL LPS刺激24h诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”，然后再用LPS进行“二次”刺激，Null VectorNaive、NLRC3Naive与shNLRC3Naive组在开始用LPS诱导耐受的时间点，先用相应培养基预处理24h，接着再给予LPS刺激，Real-time PCR检测“二次”刺激后各组细胞GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达，Seahorse XFe24生物能分析仪检测各组的细胞外酸化率（ECAR）变化；乳酸检测试剂盒检测上清液中乳酸的变化；分别用空载体（Null Vector）、NLRC3过表达、shNLRC3慢病毒载体转染骨髓来源巨噬细胞（BMDM），将细胞随机分为：Null VectorNaive、Null VectorTolerant、NLRC3Naive、NLRC3Tolerant、shNLRC3Naive与shNLRC3Tolerant组；其中，Null VectorTolerant、NLRC3Tolerant与shNLRC3Tolerant组细胞，先用100ng/mL LPS刺激24h诱导巨噬细胞耐受或“麻痹”，然后再用LPS进行“二次”刺激；Null VectorNaive、NLRC3Naive与shNLRC3Naive组在开始用LPS诱导耐受的时间点，先用RIPM1640培养基预处理24h，接着再给予LPS刺激；Real-time PCR检测各组细胞GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达，乳酸检测试剂盒检测细胞上清液中乳酸变化；
结果：与Sham组相比，CLP后6h腹腔巨噬细胞GLUT1、HK2、PFK1、PFKFB3和LDHA mRNA表达显著增加，与6h-CLP组相比，48h-CLP组腹腔巨噬细胞GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达显著降低；与Sham组相比，Sham+HK-PA组腹腔巨噬细胞中GLUT1、HK2、PFKFB3、PFK1、Enolase2、GAPDH、TPI、enolase2和LDHA mRNA表达量显著增加（P<0.05），腹腔与肺泡巨噬细胞细胞上清液中乳酸含量显著增加（P<0.05）；与Sham+HK-PA组相比，CLP+HK-PA组GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达量及乳酸含量显著降低（P<0.05）；NLRC3稳定表达或下调的Raw264.7耐受细胞，在LPS“二次”刺激时，与Null VectorTolerant和NLRC3Tolerant组相比，shNLRC3Tolerant组细胞的GLUT1、HK2、PFK1和LDHA mRNA表达、基础糖酵解率、糖酵解率、最大糖酵解率及储备糖酵解率，以及细胞上清液中乳酸含量显著增加，差异具有统计学意义（P<0.05）。
结论：NLRC3表达与脓毒症免疫麻痹小鼠的巨噬细胞有氧糖酵解紊乱有关，沉默NLRC3表达可增强免疫麻痹巨噬细胞有氧糖酵解。