【摘 要】
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Nucleophosmin／B23(NPM，numatrin，NO38)是一种多功能的核仁磷酸化蛋白。NPM与其他多种蛋白相互作用，在细胞生长和增殖中发挥重要的作用。本项目拟研究NPM与一种细胞周期素依赖激酶抑制因子，p21 WAF1／CIP1(p21)的相互作用及其在细胞中所发挥功能，并探讨两者在肝细胞癌组织中的表达及其作用。为了观察NPM与p21的相互结合，我们首先通过免疫共沉淀(co-imm
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Nucleophosmin／B23(NPM，numatrin，NO38)是一种多功能的核仁磷酸化蛋白。NPM与其他多种蛋白相互作用，在细胞生长和增殖中发挥重要的作用。本项目拟研究NPM与一种细胞周期素依赖激酶抑制因子，p21 WAF1／CIP1(p21)的相互作用及其在细胞中所发挥功能，并探讨两者在肝细胞癌组织中的表达及其作用。
为了观察NPM与p21的相互结合，我们首先通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation)，免疫印迹等实验证实了NPM与p21在体内存在相互结合，在抗癌药物体Actinomycin D(Act D)作用下，NPM与p21的相互结合显著增多；应用免疫荧光(Immunofluoreseence)方法观察到NPM与p21在共定位现象；进一步利用体外构建NPM片段突变体进行GST pull-down实验发现NPM通过C端(AA117-295)与p21相互结合。
为研究NPM对p21稳定性的调节，我们采用经典的半衰期实验，应用Cycloheximide(CHX)阻断细胞内蛋白质合成，观察到p21的半衰期很短，而NPM的半衰期则较长，但在Act D作用下，增强了NPM与p21的相互结合，使p21的降解速度显著减慢，而这种现象可以被NPM siRNA阻断。这些结果说明了NPM维持p21的稳定性。
进一步，我们探讨了NPM与p21的相互结合对细胞周期的影响。利用药物处理(Drug treatment)、免疫印迹(Immunoblotting)、细胞周期分析(cell cycle analysis)等技术观察到在NPM siRNA的作用下，NPM蛋白的表达明显下降，p21的表达也随之下调，处于S期的Hep G2细胞由17.6％上升至34.6％，发生了S期的生长抑制。同时，NPM在Act D作用下由核仁移位至核浆，p21表达上调并与NPM的共定位增强，Hep G2细胞发生了G2期阻滞；接着我们采用RNA干扰技术沉默NPM蛋白表达后再用Act D处理细胞，细胞则发生了S期阻滞。这些实验结果提示了NPM和p21的相互结合在细胞周期调控上可能有重要作用。最后，为研究NPM和p21的相互作用在肝细胞癌Hepatocelluar carcinoma (HCC)的发生发展中发挥的作用，我们检测了两者在HCC组织中的表达以及在组织水平上表达相关性。我们采用组织芯片(tissue array)、免疫组织化学(Immunohistochemistry)，统计学分析(Statistical analysisi)等方法发现了在HCC组织中，NPM与p21都呈高表达。NPM的表达与p21的阳性表达经Pearson相关分析显示相关系数为0.243，显著性检验值为0.000，为显著正相关。这些实验结果提示了它们在HCC的发生发展中可能有协同作用。
由以上的结果，我们得出以下结论：NPM通过C端与p21相互作用，并维持了p21的稳定性；NPM和p21的相互结合在细胞周期调控上可能有重要作用；在肝细胞癌中，NPM呈高表达且与p21的表达正相关，推测NPM和p21在HCC的发生发展中可能有协同作用。
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