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分泌囊是柑橘属(Citrus)植物普遍具有结构特征,除根以外,茎、叶、花和果实中均有分布,它是精油产生的主要部位。精油的产生有助于植物抵御病虫害的侵袭,保护自身正常生长发育,同时,也是重要的医药、食品和化工原料。有关柑橘类植物分泌囊的起源、发生及发育类型的研究成果颇丰,但在一些重要且关键的细胞学过程上依然模糊不清,甚至存在很大的分歧,而有关柑橘属果实分泌囊发育过程中细胞程序性死亡的研究也未见报道。本文以甜橙(Citrus sinensis L.(Osbeck))果实为材料,运用半薄切片、超薄切片技术研究了甜橙果皮分泌囊的结构、发生和发育特点,以及分泌囊发育过程中超微结构变化规律,同时运用原位末端标记检测法对分泌囊发育过程中分泌细胞程序性死亡进行了检测和观察。另外,还利用电镜酶细胞化学方法研究了分泌囊发育过程中果胶酶和纤维素酶的变化。这些研究可为揭示分泌囊起源和发生的形态学本质、精油合成场所提供科学的依据,为进一步开展相关的分子生物学研究提供细胞学基础资料。现将主要研究结果叙述如下:
1.分泌囊形成的形态学规律
根据甜橙果实分泌囊发育特点,可划分为四个时期:原始细胞团阶段、胞间隙发生阶段、空腔扩大阶段及成熟阶段。原始细胞团阶段甜橙分泌囊原始细胞起源于表皮和表皮下的一团细胞,通过这些细胞不均等的分裂,构成了分泌囊的原始细胞团。随着分泌囊原始细胞不断分裂,使得原始细胞团体积不断增大,进入胞间隙发生阶段。此时,发育的分泌囊逐渐分为帽区和球区。球区2-3个中央细胞之间的细胞壁开始膨胀,细胞角隅处出现裂缝,之后,裂缝沿着细胞壁扩展,在中央细胞间形成由4-5个细胞围绕的小腔隙。随后进入空腔扩大阶段,开始空腔的扩大主要是靠外围细胞插入内层细胞之间,增加内层上皮细胞的数目。后来,8-10个上皮细胞围绕空腔并且逐渐液泡化,进行切向的延长,快速扩大空腔。再后来,上皮细胞失去规则形态,并由内向外逐渐溶解,最终只剩1-2层上皮细胞保存。通过以上的变化,导致了腔隙进一步扩大。成熟分泌囊由帽区和球区构成。
2.分泌囊发育过程中超微结构特征
为了了解分泌囊发育过程中细胞内部超微结构变化和挥发油积累特点,进一步在电镜下观察了分泌囊发育过程。结果显示分泌囊整个发育过程中,液泡的形态变化最为明显,细胞核和细胞器也呈现规律性变化。原始细胞团阶段,细胞具有大量小液泡,细胞核大,位于细胞中央,核仁明显,有染色质凝集现象,质体较小,但数量多,没有嗜锇滴或有少量嗜锇滴即挥发油存在,可见随机分布于各个方向的内质网。空腔形成阶段细胞开始液泡化,小液泡逐渐融合形成较大液泡,并且液泡内有高电子密度物质出现,细胞核偏向细胞一侧,核仁明显,质体和线粒体丰富,且质体中有大量的嗜锇滴存在,仍可见沿各方向分布的内质网。空腔扩大阶段中央大液泡逐渐形成,细胞核和细胞质围绕大液泡,异染色质进一步凝集并边缘化,最后逐渐消失,核变形失去饱满形态,核膜局部形成泡状突起或内陷,呈现出解体状,最终核膜变模糊,出现断裂,核降解消失。质体体积变大,且质体中有黑色团块状物质形成。到空腔扩大阶段的后期细胞质变薄,各种细胞器开始变形,降解,细胞壁断裂,细胞破毁。此时最明显的变化是液泡破毁时,各细胞器,如质体、线粒体、内质网逐渐解体并形成泡状结构。内质网降解时先两端膨大,之后形成圆形的泡状结构。成熟阶段,解体的上皮细胞残留在空腔中,仅1-2层上皮细胞保留,上皮细胞扁平,并且边缘光滑,液泡化程度低。上皮细胞外围有5-8层鞘细胞包围,鞘细胞较上皮细胞液泡化程度高。整个分泌囊发育过程中,上皮细胞呈现出典型的细胞程序性死亡特点,主要包括染色质凝集、染色质边缘化、细胞核解体、液泡破毁等。
3.分泌囊发育过程中细胞程序性死亡的发现
从分泌细胞发育过程中超微结构变化特点分析,细胞的破毁呈现出程序死亡特点。为了验证我们的推断,通过原位末端标记检测的方法对甜橙果皮分泌囊不同发育时期进行了检测。结果显示分泌囊的上皮细胞中均呈现出不同程度的细胞程序性死亡信号,在原始细胞团阶段信号较弱,到胞间隙发生阶段信号增强,到空腔扩大阶段,大液泡形成,信号为最强,而成熟后信号逐渐消失。这说明甜橙果皮分泌囊发育过程中确实存在细胞程序性死亡。这些发现为确定分泌囊裂溶生发生方式提供了新的细胞学证据,同时为进一步从分子水平研究植物细胞程序性死亡提供了新的研究材料。
4.分泌囊发育过程中果胶酶和纤维素酶的细胞学定位
植物中多种发育过程都有果胶酶和纤维素酶的参与,果胶酶与纤维素酶的活动分别与中层的溶解及细胞壁的降解有关,最终导致了细胞壁的溶解和破毁。为了证明甜橙果实分泌囊发育过程中是否有果胶酶和纤维素酶参与,明确酶与细胞解体的关系,运用电镜酶化学方法对分泌囊发育过程中果胶酶和纤维素酶的变化进行了定位。结果表明其分泌囊表现为以裂溶生方式发生,分泌囊在发育早期是裂生的,原始细胞阶段只有果胶酶作用于细胞中层,到空腔形成阶段早期达到高峰,细胞间以裂生方式形成空腔,之后进入空腔扩大阶段果胶酶反应产物迅速降低直至消失。而纤维素酶在分泌囊发育早期并不作用于细胞壁,而是暂时贮存在液泡中,并在液泡中积累,到空腔扩大阶段早期才开始在细胞壁中活动,通过纤维素酶的活动,一些上皮细胞细胞壁变薄,细胞开始降解。随着纤维素酶的不断增加,上皮细胞由内向外离心式解体,导致空腔进一步扩大,分泌细胞以溶生方式扩大空腔。
5.挥发油的合成场所及分泌方式
利用常规电镜技术揭示,在分泌囊原始细胞阶段,少量嗜锇滴分布在质体中。到了空腔形成阶段早期,质体中嗜锇滴开始增多,质体周围内质网丰富,细胞质中有少量高电子密度物质;后期,质体中嗜锇滴进一步增多,同时,细胞质中高电子密度物质也增多。随后,空腔不断扩大,质体中的嗜锇滴解体形成弥散状黑色团块物。它们以渗透扩散方式进入空腔,或进入液泡,随着细胞解体液泡破毁而进入空腔。接近成熟阶段,分泌囊中有大量的精油积累贮存,上皮细胞中有质体存在,并不断向空腔内释放高电子密度物质。根据整个发育过程中精油变化说明精油合成的主要场所是在质体和细胞质,同时,线粒体、液泡、内质网均参与了精油的贮存和转运过程。
基于上述观察结果分析可知,甜橙中精油合成以后,以两种方式被分泌出质膜。一是嗜锇滴以渗透扩散方式由细胞质被排出,进入分泌囊腔。二是贮存在液泡中的油滴可以通过细胞的破毁而进入到分泌囊空腔中。