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本研究分为二部分:
第一部分、盐藻牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因DvGGPS的克隆和功能鉴定
盐藻是已知的最耐盐的真核生物之一,其最适盐浓度为1-2M NaCl,但是在接近淡水(<0.1 M NaCl)直到饱和盐水(>5M NaCl)的环境下都可以存活。此外,盐藻还可以耐受高达2200μmo1 m-2 s-1的高光强辐射。有研究表明在逆境条件下,盐藻细胞会通过改变细胞体积、合成大量甘油和类胡萝卜素以及其它抗逆相关蛋白来适应环境变化。此外,类胡萝卜素的下游产物激素ABA在盐藻耐逆过程中也发挥了重要的调控作用。目前,有关盐藻类胡萝卜素合成途径的研究都集中在上游合成类异戊二烯单体(C5)的MEP途径和下游PSY催化八氢番茄红素(C40)的合成开始的类胡萝卜素代谢途径,而对类异戊二烯单体(C5)是如何被分配到二萜代谢途径的,以及该过程是如何被调控的,还没有具体的研究。
本文首次从盐藻(Dunaliella viridis)中克隆到萜类合成途径中的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因DvGGPS。进化分析表明DvGGPS可能与细菌中的GGPS来源于一个共同的祖先。基因组杂交实验没有在D. viridis基因组中发现其它的DvGGPS同源的基因。酵母突变体功能互补实验以及原核表达实验表明DvGGPS催化GGPP的合成。烟草亚细胞定位实验结果显示DvGGPS定位于叶绿体中,表明其可能参与了盐藻叶绿体中二萜类物质的合成。Real-time PCR表达分析结果表明在1M和3M盐稳态条件下DvGGPS基因的转录水平变化不大,而高盐振荡处理和氧化剂处理均可以明显诱导该基因的表达,表明DvGGPS基因可能参与盐藻短期内对胁迫条件的适应过程。由于在高盐振荡和氧化处理5天时间内,D. viridis细胞内的类胡萝卜素总含量并没有增加,我们推测在胁迫处理短期内,盐藻D. viridis可能通过上调DvGGPS基因的表达,促进了细胞内类胡萝卜素以外其它的与抗逆相关的萜类物质的合成;但是,长期胁迫处理是否会诱导类胡萝卜素含量的增加还有待确定。
第二部分、盐藻氨转运蛋白基因DvAMT1;1和DvAMT1;2的克隆和功能鉴定
盐藻( Dunaliella)是最耐盐的真核生物之一,可以在接近饱和的盐水中生存。有蛋白组学数据表明高盐胁迫条件可以诱导NH4+转运蛋白表达量升高。为了研究盐藻N场十转运调控机制,我们根据盐藻D.viridis EST数据库信息克隆到两个编码NH4+转运蛋白的基因DvAMT1;1和DvAMT1;2。DvAMT1;1和DvAMT1;2编码的蛋白在氨基酸水平上一致性只有40%,疏水性分析表明两个蛋白均含有11个跨膜结构域。进化分析表明DvAMT1;1和DvAMT1;2属于AMT1亚家族。酵母突变体功能互补实验表明DvAMT1;1和DvAMT1;2编码有功能的NH4+转运蛋白。定量PCR结果表明两个基因在转录水平上被缺氮诱导,被外界氮源抑制,而且NH4+的抑制效应要强于N03-。在转录水平上,DvAMT1;1还明显受到光周期的调控,而DvAMT1;2表达水平比较稳定。此外,在不同盐浓度条件(0.5,1,2,3M NaCl)下,DvAMT1;1的转录物丰度随着盐浓度的升高迅速降低,而DvAMT1;2的表达水平基本不变。DvAMT1;1和DvAMT1;2在转录水平调控模式的分化可能是D. viridis适应高盐胁迫的机制之一。