论文部分内容阅读
胰腺癌（Pancreatic cancer,PC）早期症状不典型,侵袭性强,恶性程度高,对目前主要的治疗手段不敏感,预后差,五年生存率接近5%。超过80%的患者在确诊为胰腺癌时已处于疾病的晚期阶段,失去手术切除的时机。分子影像学是近年来的研究热点,分子影像学的技术和方法可用于胰腺癌的早期诊断及治疗,有望早期精准发现胰腺癌,及时诊断、治疗,改善预后。需要指出的是,目前的研究大多限于实验室及动物实验,研究中提出的一些胰腺癌新型靶向标志物仍处于探索阶段,尚未能应用于临床。CA19-9是在临床上唯一得到广泛应用的胰腺癌标志物,但是其诊断胰腺癌的特异性及敏感性不高,仅具有一定的提示价值,或用于观察胰腺癌患者对治疗的反应等。间皮素（Mesothelin,MSLN）,是一种分子量为40kDa细胞表面糖蛋白,在胰腺恶性肿瘤组织内高表达,在正常胰腺组织、急慢性胰腺炎症及良性病变中不表达,是胰腺癌的新型标志物。超顺磁性氧化铁（SPIO）纳米微粒作为MRI阴性对比剂,具有毒性小,生物相容性高等优点。本课题先在超顺磁性氧化铁SPIO（Fe3O4）微粒表面包裹一层无定形的SiO2组织,然后在其表面连接MSLN抗体,制备出新型的MRI阴性靶向磁性对比剂,分析该对比剂的表征、毒性作用,以及研究其与胰腺癌组织及细胞的体内外靶向结合能力。目的合成MSLN抗体修饰的Fe3O4@SiO2新型靶向性磁性纳米探针（A-MFS）,作为MRI阴性对比剂。观察纳米探针的表征及毒性作用,并根据该纳米探针对体外胰腺癌细胞及裸鼠皮下胰腺癌移植瘤的靶向实验,分析其作为诊断胰腺癌的阴性MRI对比剂的可行性。材料和方法一、靶向性磁性纳米探针（A-MFS）的制备根据溶剂热法合成Fe3O4纳米颗粒,然后将氨基硅烷（SiO2-NH2）包裹在Fe3O4颗粒表面,制成Fe3O4@SiO2-NH2纳米材料（FS）,最后在FS表面修饰连接MSLN抗体,合成靶向性磁性纳米探针（A-MFS）,观察该纳米探针的形态特征、分散稳定性、测量材料的流体动力直径及弛豫率。二、靶向性磁性纳米探针A-MFS的毒性实验将不同浓度的A-MFS纳米探针分别与SW1990细胞共同孵育不同时间,采用CCK-8试剂盒测定细胞的活性率;对裸鼠的多个器官进行HE染色,观察注射纳米探针后器官的病理改变。三、靶向性磁性纳米探针a-mfs的体外靶向实验将水溶性红色荧光量子点加到fs和a-mfs纳米探针上,制备荧光纳米探针,取处于对数期人胰腺癌细胞株sw1990分别与荧光纳米探针fs和a-mfs共同孵育30min,人肝癌细胞株lm-3作为对照,荧光显微镜下观察荧光纳米探针与细胞的吸附作用。胰酶消化sw1990及lm-3细胞后,分别与fs及a-mfs纳米探针共同孵育1h,然后上样进行流式细胞实验,检测纳米探针与细胞的吸附率,从而定量观察纳米探针对胰腺癌细胞的体外靶向能力。四、靶向性磁性纳米探针a-mfs的体内靶向实验（mri实验）取处于对数生长期sw1990细胞悬液（2×107/ml）0.1ml注射在裸鼠右侧腋窝皮下,注射成功后的裸鼠继续放置于spf级动物实验室内孵育,定期观察肿瘤的生长情况。从建模成功的裸鼠中,选取精神状态良好、移植瘤大小合适者,随机分三组,麻醉后在西门子3.0t磁共振仪下进行成像,各组裸鼠经尾静脉分别注射生理盐水、fs及a-mfs纳米探针,对比注射不同溶液前后裸鼠移植瘤t2wi图像,测量不同时间点移植瘤的t2wi信号强度。根据fe在肿瘤及主要器官内分布,定量分析纳米探针对移植瘤的靶向作用。并且进一步通过电镜直接观察肿瘤组织内是否含有纳米探针来验证探针的靶向性。结果一、靶向性磁性纳米探针a-mfs的表征a-mfs纳米探针成功制备,该探针大小均匀一致,流体动力直径集中在110-130nm,外观呈球形。中心黑色的部分为电子密度较高的磁核,周围灰色的部分为sio2包裹层。xps实验结果表明si和msln抗体成功连接到材料表面。a-mfs纳米探针的分散稳定性良好。a-mfs纳米探针的横向弛豫率（r2）为59.435mm/s,纵向弛豫率（r1）为0.549mm/s,r2/r1比值高,说明该纳米探针可以作为mri阴性对比剂,且阴性对比效果好。二、靶向性磁性纳米探针a-mfs的毒性cck-8实验表明,不同浓度的a-mfs纳米探针与sw1990孵育不同时间后,细胞活性始终高于85%。根据本次实验结果,a-mfs在裸鼠体内循环时间仅数小时,因此,a-mfs纳米探针基本无毒性。而且注射a-mfs后裸鼠多个器官的he染色结果,与注射生理盐水对比无差异。cck-8实验及he染色结果均表明a-mfs纳米探针的安全性高,可用于体内外实验研究。三、靶向性磁性纳米探针a-mfs的体外靶向实验A-MFS纳米探针与SW1990共同孵育后,可在细胞表面观察到较强的红色荧光信号,信号强度高于FS与SW1990、A-MFS与LM-3共同孵育后的荧光信号。流式细胞实验结果表明A-MFS与SW1990细胞的结合率最高。四、靶向性磁性纳米探针A-MFS的体内MRI靶向实验裸鼠体内MRI图像显示,经裸鼠尾静脉注射A-MFS后,移植瘤的信号逐渐减低,约2.5 h时降到最低。而注射FS和生理盐水,移植瘤的信号无明显减低。测量裸鼠移植瘤T2WI信号值显示,注射A-MFS纳米探针2.5 h时裸鼠移植瘤的T2信号强度降低了约342.533±42.6,而注射生理盐水及FS后移植瘤的T2信号强度分别降低了-61.233±33.9、-58.7±19.4,结果表明A-MFS组移植瘤的信号明显减低,与生理盐水组及FS组差异显著（P<0.05）。裸鼠移植瘤及主要器官内Fe分布结果显示,注射A-MFS纳米探针后肿瘤及肺组织（胸膜表达MSLN）内Fe含量明显高于注射FS材料组,其他器官（心、肝、脾、肾）Fe含量与注射FS材料组相仿。且A-MFS组的肿瘤组织在电镜下可观察到黑色的纳米颗粒。结论本研究将MSLN抗体连接到Fe3O4@SiO2纳米材料表面,成功制备出靶向性磁性纳米探针A-MFS。电镜下观察到A-MFS纳米探针形态规则,性质稳定,分散性良好,无毒性,具有良好的负性磁性作用。A-MFS纳米探针能够与SW1990细胞靶向性结合;并且可以使裸鼠体内移植瘤的磁共振T2WI图像信号明显减低。因此AMFS纳米探针对表达MSLN的胰腺癌细胞和组织具有良好体内外靶向作用,有望用于诊断胰腺癌及发现胰腺癌的转移灶。