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【研究目的】高血压是人类多发病。《2012年世界卫生统计》(World Health Statistics2012by World Health Organization)报告指出全球三分之一成年人患有高血压，这种病症的死亡人数约达中风和心脏病所导致的总死亡人数的一半。关于原发性高血压发病机制的研究一直是医学研究的重点内容。大量研究数据显示，肾素-血管紧张素系统(Renin-angiotensin system, RAS)的异常与高血压病的发生、发展与预后有着十分密切的关系。血管紧张素1-7[Angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]是RAS中的新成员。Ang-(1-7)可由血管紧张素1(Angiotensin I, Ang I)和血管紧张素2(Angiotensin II,Ang II)在血管紧张素转化酶(Angiotensin-convertion enzyme,ACE)和血管紧张素转化酶2(Angiotensin-convertion enzyme2, ACE2)的催化作用下生成。Ang-(1-7)是由七个氨基酸组成的多肽，通过与细胞膜表面特异性受体Mas受体(Mas recptor, MasR)结合，产生降低血压、减缓心律、降低交感神经活性、抗心肌纤维化与重构等心血管保护效应，与Ang II的作用相拮抗，从而维持心血管系统的稳态。高血压病状态下，Ang-(1-7)和Ang II平衡失调，Ang-(1-7)活性下降。因此，纠正Ang-(1-7)和Ang II的失衡状态，增强Ang-(1-7)的功能是高血压病防治的有效策略。中枢神经系统心血管调节中枢对血压、心率等心血管功能具有重要调节作用。心血管调节中枢主要位于脑干，其中较为重要的核团有孤束核(Nucleus ofsolitary tract, NTS)、头端延髓腹外侧区(Rostral ventrolateral medulla, RVLM)和尾端延髓腹外侧区（Caudal ventrolateral medulla, CVLM）等。NTS是心血管调节的第一站，具有重要的心血管调节效应。NTS接收来自外周动脉压力感受器的神经传入，并对外周信号进行初步整合，发出神经纤维投射到CVLM，通过CVLM中γV氨基丁酸(Gamma-aminobutyric acid, GABA)能神经元的抑制性中转，最终调节RVLM神经元活性，RVLM是控制交感神经活动的中枢区域。同时，NTS神经元通过兴奋性纤维投射到迷走神经中枢（如疑核等），调节迷走神经活动。NTS在维持基础血压、交感神经紧张性输出，介导压力反射等心血管功能调节中具有关键作用，NTS功能异常与高血压病的发生发展具有密切的关系。中枢神经系统中存在完整的RAS，即中枢神经系统内含有生成RAS所有成分所需的底物和酶。外周组织器官生成的Ang-(1-7)不能透过血脑屏障，因而中枢神经系统内局部生成的Ang-(1-7)发挥了重要的心血管调节作用。无论外周还是中枢神经系统，一氧化氮NO都是一个重要的信使分子，参与调节心血管、免疫等系统的功能。外周循环系统的研究已证实，Ang-(1-7)通过一氧化氮(Nitric oxide, NO)介导发挥作用。另有研究发现，NTS中NO通过调节特定神经元的活性发挥重要心血管调节效应。但中枢神经系统Ang-(1-7)的作用及机制尚不明了。NTS中Ang-(1-7)发挥心血管调节效应是否通过NO介导？其具体信号通路又是什么？本课题的研究目的在于深入探讨Ang-(1-7)在NTS发挥心血管调节功能的信号通路。【研究方法】实验使用300-350g雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠，整体动物水平观察NTS局部给予Ang-(1-7)对大鼠血压、心率、肾交感神经活动及动脉压力感受性反射等指标的影响；预处理一氧化氮合酶(Nitricoxide synthase, NOS)抑制剂L-NAME后，观察Ang-(1-7)的效应是否被阻断，以判断Ang-(1-7)发挥作用是否依赖于NOS；同时预处理Ang-(1-7)，观察其对L-NAME心血管效应的影响；使用相应的分子生物学方法检测大鼠NTS急性给予Ang-(1-7)后的NO含量及NOS活性，并使用工具药和小RNA干扰技术(siRNA interferring technology)等方法进一步研究其作用机制；调研文献后选出MasR/PI3K/Akt通路作为研究对象，使用Western Blot检测大鼠NTS急性给予Ang-(1-7)后Akt、nNOS和eNOS的磷酸化水平，给予MasR阻断剂（A779）、PI3K抑制剂（LY294002）和Akt抑制剂（TCN）后Ang-(1-7)的上述磷酸化效应是否被消除；同时在整体动物水平，研究给予上述通路靶点蛋白阻断剂或抑制剂后， Ang-(1-7)的心血管效应是否被消除；使用小RNA干扰技术特异性干扰大鼠NTS区域神经细胞PI3Kp110δ，亚基的表达，15天后Western Blot检测大鼠NTS急性给予Ang-(1-7)后NO含量及Akt、nNOS和eNOS的磷酸化水平，进一步验证PI3K在信号通路中的位置；使用免疫荧光共定位方法观察NTS中是否存在MasR与nNOS的共表达，从组织分布上确定两者存在相互作用的可能性。【结果】一、 NTS局部注射Ang-(1-7)对心血管活动的影响NTS单侧微量注射Ang-(1-7)(25pmol/50nl)可降低血压（-12.8±1.8mmHg）、减缓心率(-22.0±3.1beats/min)和降低肾交感神经活动(-15.8±2.0%)；NTS双侧微量注射Ang-(1-7)(25pmol/50nl)可显著增强动脉压力感受性反射(ABR)(从1.0强动脉压升高至1.8动脉压力感受性反射ats/mi。二、 NTS预处理L-NAME可改变局部注射Ang-(1-7)对心血管活动的影响溶剂对照组大鼠NTS局部注射Ang-(1-7)可降低血压、减慢心率和下降肾交感神经活动；预处理NOS阻断剂L-NAME后，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)的降压幅度减小，减慢心率的作用被逆转，降低的肾交感神经活动效应也被逆转(P<0.05)。三、 NTS局部注射Ang-(1-7)能够增强L-NAME升血压、加快心率和升肾交感神经活动的效应，Ang-(1-7)的这一效应可被MasR阻断剂和PI3K抑制剂消除NTS预处理溶剂(人工脑脊液, aCSF)后给予L-NAME可产生升血压、加快心率和升肾交感神经兴奋性的作用；与预处理溶剂组相比，预处理Ang-(1-7)可使L-NAME升血压、加快心率和增强肾交感神经活动的作用加强(P<0.05)；预处理MasR阻断剂A779可减弱Ang-(1-7)对L-NAME的易化作用(P<0.05)；预处理PI3K抑制剂LY294002可完全消除Ang-(1-7)对L-NAME的易化作用(P<0.05)。与溶剂对照组相比，各组大鼠NTS局部注射L-NAME前血压、心率等指标均无显著性差异（P>0.05)。四、 Ang-(1-7)能够上调NO含量和NOS活性，这一效应通过MasR/PI3K/Akt通路介导与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)能够增加NO的生成（平均升高34%，P<0.05），并提高总NOS的活性（平均升高38%，P<0.05）。使用A779、LY294002和TCN能够阻断Ang-(1-7)的上述效应(P<0.05)。与溶剂对照组相比，单独给予A779、LY294002或TCN不影响NO含量（P>0.05)。五、 Ang-(1-7)可刺激Akt和NOS磷酸化，这一效应通过MasR/PI3K/Akt通路介导Western blot结果显示，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)能够增加Akt Ser473、nNOS Ser1416和eNOS Ser1177相应位点的磷酸化水平(P<0.05)。与Ang-(1-7)组相比，使用A779、LY294002能够消除Ang-(1-7)对Akt的磷酸化效应(P>0.05)，使用A779、LY294002或TCN能够消除Ang-(1-7)对nNOS/eNOS的磷酸化效应(P>0.05)。六、慢病毒转染干扰PI3K表达后，Ang-(1-7)增加Akt、nNOS和eNOS磷酸化的效应被抑制，进而导致Ang-(1-7)增加NO生成的效应被抑制PI3K siRNA干扰慢病毒(LenVi-PI3K KD)或空载慢病毒(LenVi-GFP)局部感染NTS，15天之后NTS急性给予Ang-(1-7)进行后续检测。Western blot结果显示，NTS局部感染LenVi-GFP后，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)能够增加AktSer473、nNOS Ser1416和eNOS Ser1177位点的磷酸化水平(P<0.05)，进而增加NO含量(P<0.05)；NTS局部感染LenVi-PI3K KD后，与溶剂对照组相比，Ang-(1-7)不能增加Akt Ser473、nNOS Ser1416和eNOS Ser1177相应位点的磷酸化水平(P>0.05)，也不能增加NO含量(P>0.05)。七、 MasR和nNOS免疫荧光共定位免疫荧光共定位结果显示，MasR(绿色荧光)和nNOS(红色荧光)可在同一NTS神经细胞内共表达，提示nNOS与Ang-(1-7)/MasR之间可能存在密切联系。【结论】Ang-(1-7)上调NTS中NO生成，进而产生降低血压、减缓心率、降低交感神经活性等心血管效应，这一效应是通过MasR/PI3K/Akt/NOS通路介导的。