T6-17细胞膜表面P185蛋白表达的研究及生物素-亲和素蛋白芯片检测方法的建立

• 作 者: 胡春芃
• 机 构: 安徽医科大学
• 出 处: 安徽医科大学
• 发表日期: 2010年01期
• 关键词: 卵巢肿瘤 肿瘤诊断 血清抗原 蛋白检验 T6-17细胞膜 P185蛋白

目的：用免疫组化法检测T6-17细胞膜表面肿瘤标志物P185蛋白的表达量和分布情况，再从细胞上清中纯化P185蛋白作为阳性对照，将BAS和蛋白芯片技术结合，建立卵巢癌患者血清中肿瘤抗原P185蛋白的检测方法。　　
方法：六孔板中内置多聚赖氨酸处理过的盖玻片，加入T6-17细胞培养制备成细胞爬片，4％甲醛固定，0.1％ TritonX-100工作液处理增加通透性，PBS洗涤后用免疫组化SP法处理，DAB显色并与石蜡切片免疫组化结果比较。采用溴化氰活化的Sepharose 4B为基质，通过交联A18 mAb，用亲和层析的技术纯化p185蛋白作为阳性对照。自制单克隆抗体A18为一抗，生物素化单克隆抗体Bio-A21为二抗，金基底芯片为载体，荧光物质Cy3为标记，经抗原抗体反应后，GenePix4100A芯片扫描仪扫描读数，根据荧光值摸索最佳反应条件，确定P185蛋白在卵巢癌中的阳性率,并与BA-Elisa结果进行比较。　　
结果：免疫组化结果显示P185蛋白主要分布于细胞膜上。从转基因细胞上清中成功获取肿瘤抗原P185蛋白。联合BAS的蛋白芯片的检测效率提高5倍左右，该检测方法的最佳反应条件是包被浓度6.25μg/ml，37°C孵育4h，样品缓冲液选择1％BSA-PBS。卵巢癌患者血清中P185阳性率为15.4％～18.5％，与BA-Elisa的结果一致。　　
结论：证实T6-17细胞膜表面表达P185蛋白，初步建立了BAS的抗体芯片检测方法。证实P185蛋白阳性率与卵巢癌发展有关，具有广阔的临床应用前景。