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流行性感冒是由流感病毒引起的一种人畜共患急性呼吸道传染病。虽然疫苗是预防流感病毒感染的最佳选择,但流感病毒抗原易变异可能使疫苗与变异的流行毒株不匹配而使疫苗无效。因此,药物防治对流感防控具有重要意义。至今,只有两类抗流感病毒药物经核准认可:M2离子通道阻滞剂如金刚烷胺和金刚乙胺:神经氨酸酶抑制剂如奥司他韦或扎拉米韦。金刚烷胺和它的衍牛物用于治疗时迅速导致耐药株的出现,不能推广成为自由使用的抗流感药物。此外,B型流感病毒对金刚烷胺不敏感。近年有报道随着神经氨酸酶抑制剂使用的增加,其耐药毒株也日渐增多。因此,研制开发新型高效抗流感药物,以应对新的流感大流行,是目前国际医药界的前沿课题和研究热点。
苹果多酚和花青素是常见的植物来源多酚类物质,具有抗氧化、抗有害微牛物等多种活性,但其抗流感病毒活性方面的研究较少。本论文通过细胞感染试验和血凝抑制试验系统地评价了苹果多酚和花青素体外对流感病毒的抑制作用,探究其可能的作用机制。本论文还研究了苹果多酚对感染流感病毒小鼠致死的保护作用,初步评价苹果多酚动物体内的抗流感效果。
细胞感染试验结果表明,苹果多酚和花青素对感染H9N2、H1N1和H3N2三种亚型流感病毒的MDCK细胞均有不同程度的保护作用,苹果多酚IC50分别为0.012、0.0032和0.0042 mg/mL,花青素IC50分别为0.044、0.024和0.044 mg/mL。进一步考察了预防模式(先加药后接种病毒)、治疗模式(先感染病毒后加药)和同时作用(药与病毒作用30min后感染细胞)三种作用方式下,苹果多酚和花青素对感染流感病毒MDCK细胞的保护作用。结果表明,苹果多酚和花青素与流感病毒同时作用效果最好,IC50分别在(7.12±0.14～7.63±0.21)×10-4mg/mL和(1.11±0.14～1.56±0.21)×10-3mg/mL范围内。不同作用时间点结果表明,苹果多酚有效阻断流感病毒的吸附和穿入阶段,对病毒复制中期和释放阶段无抑制作用,而花青素对流感病毒复制各阶段具有显著的抑制作用。二者对感染流感病毒前的MDCK细胞无保护作用。
血凝抑制试验:通过考察苹果多酚和花青素对流感病毒表面的重要抗原-血凝素(HA)的抑制作用,从而确定HA是否是其抑制病毒的作用靶点。结果表明,苹果多酚能明显抑制H9N2、H1N1、H3N2三种亚型流感病毒对鸡红细胞的血凝作用,MIC值分别为0.50,0.25和0.25 mg/mL,但花青素的血凝抑制作用不明显。
小鼠感染试验:利用H1N1亚型流感病毒感染小鼠模型,研究了苹果多酚对感染流感病毒小鼠的保护作用,结果显示200mg/kg/d苹果多酚对感染H1N1亚型流感病毒有明显的保护作用(P＜0.01),保护率为44.4％,小于利巴韦林组(88.9%)。
由上述各试验结果可得出,苹果多酚和花青素对感染流感病毒MDCK细胞均有显著保护作用。苹果多酚对H1N1流感病毒感染小鼠具有显著的保护作用,具有临床应用前景,值得进一步研究。