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犬瘟热（Caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒（Caninedistempervirus,CDV)引起的犬科和其它肉食动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病已在全世界流行，随着病毒的进化，由传统的仅感染犬科动物，逐步威胁到野生肉食动物。 反向遗传操作技术（Reversegenetics)是分子病毒学研究领域的一种新型技术，是指通过构建RNA病毒感染性克隆达到模拟真实病毒粒子，进入细胞复制以及传代从而得到具有真实感染性的病毒颗粒的过程。本试验主要研究以下内容。 1.为了研究犬瘟热病毒野毒株在Vero-SLAM细胞上连续传代培养后的基因变异情况，将本实验室保存的一株已知全基因组序列的犬瘟热野毒Hebei株在Vero-SLAM细胞上连续传12代，选择TaKaRaExTaq酶进行RT-PCR，扩增覆盖其全长基因组的10个末端重叠的片段，获得Hebei株全长基因组序列，分析Hebei株在传代到12代后与初始序列的差异。结果表明Hebei株传代后较初始全基因序列有24处碱基突变，14处氨基酸突变。造成这种突变的原因可能是TakaraExTaq酶非高保真酶，PCR过程中有一定的突变率；PCR产物克隆到T载体导致测序失真；犬瘟热病毒强毒株经Vero-SLAM细胞多次传代培养后发生基因变异。 2.为了避免细胞传代及克隆测序的影响，本试验对CDVSD16F株分离株的第5代细胞毒，设计覆盖其全长基因组的多个末端重叠的引物，用TaKaRa公司的高保真酶TksGflexDNAPolymerase扩增，对扩增出的各段基因片段直接测序并使用MegAlign进行拼接。结果表明，成功获得SD16F株的全长基因组序列，与GenBank登录的21株CDV参考毒株的全基因核苷酸序列同源性为91.9%-99.5%，其中，亲缘性最近的是SD(14)7株，同源性为99.5%，与国内疫苗株CDV3同源性为92.1%，与Onderstepoort株亲缘关系最远，同源性为91.9%。进化树分析显示SD16F株属于AsiaI型。全长基因组序列的获得为接下来构建SD16F株全长感染性cDNA克隆奠定基础。 3.为了构建SD16F株全长cDNA克隆，本试验采用In-Fusion?HDCloningKit无缝连接技术分三步克隆，第一步是3’端克隆，将丁型肝炎病毒核酶（HdvRz)全部序列添加到引物中，根据NheI和NotI限制性酶切位点克隆到pCI载体上，命名为pCI-CDV-3’；第二步扩增出中间序列以SphI酶切位点插入到pCI-CDV-3’质粒中，命名为pCI-CDV-3’-Plus，第三步克隆是5’端克隆，将锤头核酶（HamRz)全部序列添加到引物中去，以SphI酶切位点插入到pCI-CDV-3’-Plus，重组质粒的克隆送去TaKaRa公司测序。结果表明，重组质粒中的CDV全基因组序列与试验二获得的全长基因序列完全一致，将重组的最终全长cDNA克隆质粒命名为pCI-CDV-SD16F。 4.犬瘟热病毒反向遗传技术体系主要是构建RNA病毒基因组全长cDNA克隆及辅助质粒，其中辅助质粒分别表达N、P、L三个功能蛋白，本试验通过RT-PCR方法扩增N、P、L开放阅读框基因，将扩增出的DNA片段与真核表达载体pCI连接，并将重组质粒转染Vero-SLAM细胞，RT-PCR和IPMA方法验证其表达情况。结果表明经过质粒酶切鉴定和测序结果鉴定确定了三种辅助蛋白基因真核表达载体构建成功，分别命名为pCI-SD16F-N、pCI-SD16F-P和pCI-SD16F-L，RT-PCR能够检测到重组质粒的转录产物，IPMA能够观察到pCI-SD16F-N转染细胞中N蛋白特异性着色细胞。这为进一步进行该病毒的拯救奠定基础。