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目的 卵巢恶性肿瘤是女性生殖器三大恶性肿瘤之一，其临床生物学行为特点是起病隐匿、发展迅速，临床诊断时多为晚期。因此，5年生存率仅为20％左右，是病死率最高的妇科恶性肿瘤。至今仍缺乏有效的早期诊断方法。随着分子生物学技术和理论的迅速发展，基因治疗这一新型治疗方法逐渐登上历史舞台，医学家们试图从基因的分子水平探讨某种基因变化和卵巢癌临床生物学行为之间的关系，以期提供较准确和有效的诊断、治疗和预防手段。 RASSF1A是Ras家族的一个新成员，它被认为主要调节细胞的增生与凋亡，自2000年Dammann等利用酵母双杂交筛选的方法成功地克隆RASSF1基因以来，研究发现，RASSF1可以调节有丝分裂的进程，参与细胞周期的调控，在体内和体外抑制细胞生长，并参与诱导细胞凋亡;该基因在多种肿瘤中存在着广泛的表达缺失和启动子区的异常甲基化，预示着该基因在多种肿瘤的发生发展中发挥重要作用。 本研究拟通过RT-PCR技术检测RASSF1A基因在卵巢癌组织及卵巢癌细胞系中的表达情况，来探讨其在卵巢癌发病中的意义;通过应用外源性RASSF1A基因转染不表达RASSF1A基因的卵巢癌细胞系SKOV-3细胞，对转染后SKOV-3细胞的生物学行为进行研究，以探讨RASSF1A基因对卵巢上皮性癌细胞周期及凋亡的影响;通过对转染RASSF1A基因前后的SKOV-3细胞中增殖相关蛋白Survivin、cyclinD1和凋亡相关蛋白P27、caspase-3的检测来探讨RASSF1A基因对卵巢癌细胞增殖与凋亡的影响。 材料与方法 一、材料 1、组织标本来源:我院妇产科2005年9月至2008年1月单一行妇科手术治疗的47例卵巢上皮性恶性肿瘤患者，选择同期行卵巢剖检及因病行预防性卵巢切除的正常卵巢患者10例为对照组，均经病理学确诊。每例患者无菌取材，离体后迅速放入液氮中冻存，后转入-80℃冰箱保存。 2、细胞系来源:上皮性卵巢癌细胞系HO8910、HO8910PM、SKOV-3、OVCAR-3购自中国科学院细胞库。 3、RNA提取试剂。 4、RT-PCR相关试剂 5、Westernblot相关试剂 二、方法 （一）RASSF1A基因在卵巢癌中的表达及意义 1、RT-PCR方法检测RASSF1A基因在47例上皮性卵巢癌和10例正常卵巢组织中的表达; 2、RT-PCR方法检测RASSF1A基因在四种上皮性卵巢癌细胞系HO8910、HO8910PM、SKOV-3、OVCAR-3中的表达。 （二）RASSF1A基因对卵巢上皮性癌细胞周期及凋亡的影响 1、用包含RASSF1A基因全长的腺病毒转染不表达RASSF1A基因的SKOV-3细胞; 2、RT-PCR方法检测RASSF1A基因在转染后的表达; 3、荧光显微镜观察转染前后SKOV-3细胞的形态变化; 4、透射电镜观察转染前后SKOV-3细胞的结构变化; 5、流式细胞仪检测转染RASSF1A基因对SKOV-3细胞的细胞周期及凋亡的影响。 （三）RASSF1A基因对卵巢癌细胞的增殖与凋亡相关蛋白的影响 1、用包含RASSF1A基因全长的腺病毒转染不表达RASSF1A基因的SKOV-3细胞; 2、通过WESTERN-BLOT方法检测转染前后SKOV-3细胞中增殖相关蛋白survivin、cyclinD1的表达及凋亡相关蛋白P27、caspase-3的表达。 结果 一、PASSF1A基因在卵巢癌中的表达 1、RASSF1A在卵巢癌细胞系中的表达:HO8910、HO8910PM、SKOV-3、OVCAR-3中，RASSF1A在SKOV-3和OVCAR-3中表达缺失，在HO8910和HO8910PM中有表达; 2、RASSF1A的mRNA在正常卵巢组织和癌组织中的表达:RASSF1A在正常卵巢组织中的表达率为100％(10/10)，在47例卵巢癌组织中的表达率为4.3％(2/47)，两者之间差异有统计学意义(P＜0.05)。 二、RASSF1A基因对卵巢上皮性癌细胞周期及凋亡的影响 1、转染效率的观察:在转染24小时后在荧光显微镜下观察转染效率，见转染效率接近100％; 2、SKOV-3细胞中RASSF1A基因表达的鉴定:RT-PCR技术检测结果显示，转染空白病毒的SKOV-3细胞无RASSF1A基因的表达，转染含RASSF1A基因病毒的SKOV-3细胞有RASSF1A基因的强烈表达; 3、细胞形态的观察:转染24小时后在荧光显微镜下观察SKOV-3细胞的形态变化，未转染的SKOV-3细胞在正常生长状态下，细胞呈条状，细胞表面有突起;而转染后的细胞生长出现受抑制的特征，如细胞呈圆形，体积增大，细胞核为空泡状，可见2-3个核仁; 4、转染后细胞生长情况的观察:同等条件下培养的转染RASSF1A基因后的细胞数明显低于未转染组，并随着转染时间的延长大量死亡; 5、转染后细胞结构的观察:转染RASSF1A基因后的SKOV-3细胞和未转染细胞比较，出现了明显的核染色质固缩边聚或中聚、凝集成块，可见到有凋亡小体形成。 6、流式细胞仪结果:转染了含RASSF1A基因的病毒的SKOV-3细胞的凋亡比率明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05)。 三、RASSF1A基因对卵巢癌细胞的增殖与凋亡相关蛋白的影响 1、在RASSF1A基因表达缺失的卵巢癌细胞系SKOV-3中，转染入RASSF1A基因后，其增殖相关蛋白cyclinD1和suvivin的表达均明显降低(P＜0.05); 2、在RASSF1A基因表达缺失的卵巢癌细胞系SKOV-3中，转染入RASSF1A基因后，凋亡相关蛋白P27和caspase-3的表达明显升高(P＜0.05)。 结论 1、RASSF1A基因在正常卵巢组织中完全表达，在卵巢癌组织中存在大量的表达缺失; 2、RASSF1A基因在卵巢癌细胞系SKOV-3和OVCAR-3中表达缺失，在HO8910和HO8910PM中有表达; 3、RASSF1A基因对凋亡有明显的促进作用; 4、RASSF1A基因在卵巢癌细胞中可以促进凋亡相关蛋白P27和caspase-3的表达;同时抑制增殖相关蛋白cyclinD1和suvivin的表达。