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半月板在膝关节具有传导载荷,维持关节稳定的重要功能,其损伤将严重限制膝关节运动功能。由于半月板仅红区有血供,红.白区、白区无血供,其营养主要来自关节内的滑液。半月板损伤后,愈合的组织细胞主要来源于滑膜,关节液及纤维软骨内的成纤维细胞。目前临床对半月板损伤采用手术治疗,一般为切除受损部分,虽可解决症状,但术后半月板缺失,功能丧失,患者易早期发生骨性关节炎(osteoarthritis,OA)。OA临床终术结局往往是人工关节置换,对患者造成较重的经济和心理负担。早期研究均认为由于半月板自身愈合能力差,几乎无愈合能力。但近年临床实践研究发现,合并前交叉韧带(anterior crueiate ligament,ACL)损伤、行ACL重建术的损伤半月板存在愈合倾向。关于半月板愈合的基础研究证实TGF-β1、HGF、EGF、BMP、PDGF等因子增加关节软骨细胞DNA合成,促进软骨细胞增殖。多数研究认为TGF-β1具有较强的促进半月板愈合作用。但上述研究并未考虑:TGF-β1/Smads信号转导通路作用为促进炎症反应,其中TGF-β1是中性粒细胞和单核细胞的有力趋化剂,其体内过度表达或引入外源性TGF-β1可引发或加重炎症反应,阻碍正常组织修复,无法达到组织工程意义上的功能性修复目标。而目前尚无研究阐诉TGF-β1体内异构体-TGF-β3,在半月板发育、损伤修复中作用。己发表研究指出:TGF-β3未参与软骨损伤、基质降解等炎症反应过程,且促进肺和肝脏组织的纤维性修复过程。明确TGF-β3在半月板发育中作用,可为半月板组织工程研究提供新的理论基础和研究方向。
材料和方法:
选择鼠龄1天、7天、14天、21天、28天、35天Wistar大鼠(中国医科大学动物部提供),无菌操作条件下取不同大鼠完整膝关节,固定、脱钙、石蜡包埋及切片后,采用S-P法作免疫组化,以Image-Pro Plus6.0图像分析软件采集图像并观察分析。采用上述鼠龄大鼠,拖颈处死后浸泡于75％酒精中5分钟,无菌操作下取大鼠双侧半月板(1天、7天在显微镜下取材),Tizol法提取细胞总RNA,RNA定量为1μg/μl并行电泳纯度检测,MLV试剂盒逆转录合成cDNA第一链,PCR反应体系(50μl):eDNA模板5μl+上下游引物各1μl+Premix LA Taq聚合酶25μl+dd H2018μl,反应条件:98℃10秒,55℃30秒,72℃28秒,共35个循环。10％琼脂糖电泳鉴定产物,数码照相并行灰度值分析(Labwork4.0分析软件)。以目的产物狄度值表示结果。
结果:
1、免疫组化发现大鼠由出生到成鼠过程中,TGF-β3表达从关节囊丌始逐渐扩展至红区、红白区、白区;
2、RT-PCR结果显示上述过程中TGF-β3表达增加(1天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值77.618、7天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值80.855、14天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值84.238、21天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值93.061、28天wistar大鼠半月板中TGF-β3mRNA的灰度值94.801、35天wistar大鼠半月板中TGF-β3 mRNA的灰度值94.863),生长至成鼠(成鼠标准100g/只)后表达趋于稳定。
结论:
不同鼠龄的半月板中TGF-β3均可见表达,发育过程中TGF-β3表达逐渐增加,至成鼠后表达情况趋于稳定。