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凝血系统和抗凝血系统在体内的动态平衡维持着机体正常的血液流动，一方缺陷或损伤都会影响机体的正常血液循环。凝血系统在机体的血管内皮细胞损伤后通过激活一系列凝血因子发生级联反应形成牢固的纤维蛋白，防止机体过度出血。而抗凝血机制与凝血机制相互制约保持着稳定，蛋白C（ProteinC，PC）是除了抗凝血酶（Antithrombin，AT）以外，机体内抗凝系统中主要的抗凝物质，活化蛋白C（ActivatedproteinC，APC）在蛋白S（ProteinS，PS）的辅助下，形成的复合物可以灭活活化的凝血因子Ⅴ（activatedcoagulationfactorⅤ，FⅤa）和活化的凝血因子Ⅷ（activatedcoagulationfactorⅧ，FⅧa）发挥主要抗凝作用。凝血系统缺陷容易造成出血倾向而抗凝血系统缺陷容易造成血栓形成倾向。遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症（hereditaryFⅪdeficiency）和遗传性蛋白C缺陷症（hereditaryproteinCdeficiency）都是由编码相应蛋白的F11基因和PROC基因发生突变引起机体凝血系统和抗凝血系统异常的疾病。本研究对一个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系和一个遗传性蛋白C缺陷症家系进行表型诊断和基因型分析，旨在初步探讨其分子致病机制。
目的
对一个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症和一个遗传性蛋白C缺陷症家系家庭所有成员进行实验室表型及基因突变检测，明确致病基因，并运用蛋白模型和多个生物信息学软件对突变位点进行分析，初步探讨其分子致病机制。
方法
1.先证者及家系病史采集：
1.1.先证者1为一名64岁的中国女性，农民，从事农业劳作。本次因“右下肢静脉迂曲扩张40余年，色素沉着6年，行动不便”入院。患者40余年前出现右下肢静脉曲张，病情逐渐加重，右下肢可见较多的增粗迂曲浅静脉，偶有右下肢皮肤瘙痒。B超显示两侧下肢深静脉无异常，临床诊断为“右下肢静脉机能不全”。凝血常规检查发现活化部分凝血活酶时间（ActivatedPartialThromboplastinTime，APTT）延长，为59.3s/36.0s；凝血因子Ⅺ活性（coagulationfactorⅪactivity，FⅪ:C）为13%明显降低；而凝血因子Ⅺ抗原（coagulationfactorⅪantigen，FⅪ:Ag）在正常范围内，为76%；其他相关凝血指标均在参考范围，诊断为Ⅱ型FⅪ缺陷症。先证者1家系共3代6人，除先证者有下肢静脉异常外，其他成员无此症状出现。该家系先证者的父亲与母亲为近亲结婚。
1.2.先证者2为一名39岁的中国女性，无业。患者4年余前双下肢开始疼痛，行走后加重，左下肢伴肿胀活动受限，检查诊断为“下肢深静脉血栓形成”，长期不规则口服华法林抗凝。现因双下肢再次疼痛住院治疗，检查发现下肢深静脉顺行造影结果显示左小腿深静脉血栓形成，蛋白C活性为39%，抗核抗体阳性。临床诊断为“左下肢深静脉血栓形成，蛋白C缺陷症，系统性红斑狼疮（SystemicLupusErythematosus，SLE）”。先证者2家系共3代6人，除先证者外其余成员无血栓类症状出现。了解家庭病史后得知先证者的父亲47岁时不明原因发生脑静脉窦血栓死亡，哥哥44岁时发生肺栓塞死亡。
2.实验室检测：收集两个先证者及其家系成员的外周静脉血，用枸橼酸钠抗凝后离心，在全自动血凝仪上采用凝固法检测APTT、凝血酶原时间（prothrombintime，PT）、凝血因子Ⅷ活性（coagulationfactorⅧactivity，FⅧ:C）、凝血因子Ⅸ活性（coagulationfactorⅨactivity，FⅨ:C）、FⅪ:C、凝血因子Ⅻ活性（coagulationfactorⅫactivity，FⅫ:C）和蛋白S活性（proteinSactivity，PS:A）；免疫比浊法检测D-二聚体（D-Dimer，D-D）；发色底物法检测蛋白C活性（proteinCactivity，PC:A）和抗凝血酶活性（Antithrombinactivity，AT:A）；酶联免疫吸附试验法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）检测FⅪ:Ag和蛋白C抗原（proteinCantigen，PC:Ag）水平。
3.基因型检测：提取两个家系的外周血基因组DNA；设计引物，聚合酶链式反应（Polymerasechaineaction，PCR）扩增产物包含F11基因和PROC基因所有外显子和侧翼序列，以及3’、5’端非编码区。纯化后的扩增产物进行直接测序，然后与美国国立生物信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）提供的F11基因（GenBankAY191837）和PROC基因（GenBankAF378903）序列进行比对，寻找突变位点，反向测序进行验证该异常位点。
4.数据处理分析：用多序列比对软件ClustalX-2.1-win分析基因突变位点的保守性；用PolyPhen-2、PROVEAN和MutationTaster三个在线生物信息学软件，通过评分结果预测碱基突变后对整个蛋白质功能的影响；同时用Swiss-pdbViewer-4.01和Pymol软件根据蛋白数据库（Proteindatabase，PDB）提供的野生蛋白三维结构模型，构建点突变后突变型蛋白模型，分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变。
结果
1.先证者1的FⅪ:C降低到13%，FⅪ:Ag含量正常为76%；测序结果发现F11基因的13号外显子存在一个纯合错义点突变c.1562A＞G（p.Tyr503Cys）。先证者的母亲、女儿和儿子携带有该位点的杂合突变，其FⅪ:C均降低至正常值的50%左右，而FⅪ:Ag含量正常；妹妹和配偶的FⅪ:C和FⅪ:Ag含量均正常，基因测序为野生型。
2.先证者2的PC:A和PC:Ag均明显降低，分别为正常对照的39%和45%；测序结果发现PROC基因的9号外显子存在一个杂合错义点突变c.997A＞G（p.Ala291Thr）。先证者二姐和儿子的PROC基因存在相同的突变位点，两者的PC:A和PC:Ag均降低至正常值的50%左右。
3.多序列比对软件ClustalX分析结果表明，F11基因的Tyr503氨基酸残基在同源物种间高度保守，而PROC基因的Ala291氨基酸残基呈弱保守性。PolyPhen-2、PROVEAN和MutationTaster三个生物学软件显示F11基因的p.Tyr503Cys为有害突变，能影响相应蛋白的功能，引起疾病；PolyPhen-2预测PROC基因的p.Ala291Thr为有害突变。FⅪ蛋白模型分析显示，在野生型FⅪ蛋白质中，芳香族Tyr503残基与Leu506及Ile510存在疏水作用力，与Lys554、Ile370主链形成氢键；突变型Cys503的疏水作用力消失，与Lys554、Ile370形成的氢键没有改变，但由于Cys503分子侧链变短，与Lys554侧链又增加了一个氢键。PC蛋白模型分析显示，突变前，Ala291与Pro327之间存在疏水作用力，当Ala291突变成极性亲水的氨基酸Thr291后，其侧链变长，与Pro327之间的疏水作用消失，而二者之间产生一个结合更为牢固的氢键。
结论
1.遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的先证者FⅪ:C降低，FⅪ:Ag含量正常，为Ⅱ型FⅪ缺陷症；先证者F11基因的13号外显子存在纯合c.1562A＞G，导致p.Tyr503Cys错义突变。p.Tyr503Cys与该家系FⅪ水平降低有关。
2.遗传性蛋白C缺陷症家系的先证者，PC:A和PC:Ag均降低，为Ⅰ型蛋白C缺陷症；先证者PROC基因的9号外显子存在杂合c.997A＞G，导致p.Ala291Thr错义突变。p.Ala291Thr与该家系PC水平降低有关。
3.该遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症的p.Tyr503Cys错义突变和遗传性蛋白C缺陷症的p.Ala291Thr错义突变均为国内外首次报道。
目的
对一个遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症和一个遗传性蛋白C缺陷症家系家庭所有成员进行实验室表型及基因突变检测，明确致病基因，并运用蛋白模型和多个生物信息学软件对突变位点进行分析，初步探讨其分子致病机制。
方法
1.先证者及家系病史采集：
1.1.先证者1为一名64岁的中国女性，农民，从事农业劳作。本次因“右下肢静脉迂曲扩张40余年，色素沉着6年，行动不便”入院。患者40余年前出现右下肢静脉曲张，病情逐渐加重，右下肢可见较多的增粗迂曲浅静脉，偶有右下肢皮肤瘙痒。B超显示两侧下肢深静脉无异常，临床诊断为“右下肢静脉机能不全”。凝血常规检查发现活化部分凝血活酶时间（ActivatedPartialThromboplastinTime，APTT）延长，为59.3s/36.0s；凝血因子Ⅺ活性（coagulationfactorⅪactivity，FⅪ:C）为13%明显降低；而凝血因子Ⅺ抗原（coagulationfactorⅪantigen，FⅪ:Ag）在正常范围内，为76%；其他相关凝血指标均在参考范围，诊断为Ⅱ型FⅪ缺陷症。先证者1家系共3代6人，除先证者有下肢静脉异常外，其他成员无此症状出现。该家系先证者的父亲与母亲为近亲结婚。
1.2.先证者2为一名39岁的中国女性，无业。患者4年余前双下肢开始疼痛，行走后加重，左下肢伴肿胀活动受限，检查诊断为“下肢深静脉血栓形成”，长期不规则口服华法林抗凝。现因双下肢再次疼痛住院治疗，检查发现下肢深静脉顺行造影结果显示左小腿深静脉血栓形成，蛋白C活性为39%，抗核抗体阳性。临床诊断为“左下肢深静脉血栓形成，蛋白C缺陷症，系统性红斑狼疮（SystemicLupusErythematosus，SLE）”。先证者2家系共3代6人，除先证者外其余成员无血栓类症状出现。了解家庭病史后得知先证者的父亲47岁时不明原因发生脑静脉窦血栓死亡，哥哥44岁时发生肺栓塞死亡。
2.实验室检测：收集两个先证者及其家系成员的外周静脉血，用枸橼酸钠抗凝后离心，在全自动血凝仪上采用凝固法检测APTT、凝血酶原时间（prothrombintime，PT）、凝血因子Ⅷ活性（coagulationfactorⅧactivity，FⅧ:C）、凝血因子Ⅸ活性（coagulationfactorⅨactivity，FⅨ:C）、FⅪ:C、凝血因子Ⅻ活性（coagulationfactorⅫactivity，FⅫ:C）和蛋白S活性（proteinSactivity，PS:A）；免疫比浊法检测D-二聚体（D-Dimer，D-D）；发色底物法检测蛋白C活性（proteinCactivity，PC:A）和抗凝血酶活性（Antithrombinactivity，AT:A）；酶联免疫吸附试验法（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）检测FⅪ:Ag和蛋白C抗原（proteinCantigen，PC:Ag）水平。
3.基因型检测：提取两个家系的外周血基因组DNA；设计引物，聚合酶链式反应（Polymerasechaineaction，PCR）扩增产物包含F11基因和PROC基因所有外显子和侧翼序列，以及3’、5’端非编码区。纯化后的扩增产物进行直接测序，然后与美国国立生物信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation，NCBI）提供的F11基因（GenBankAY191837）和PROC基因（GenBankAF378903）序列进行比对，寻找突变位点，反向测序进行验证该异常位点。
4.数据处理分析：用多序列比对软件ClustalX-2.1-win分析基因突变位点的保守性；用PolyPhen-2、PROVEAN和MutationTaster三个在线生物信息学软件，通过评分结果预测碱基突变后对整个蛋白质功能的影响；同时用Swiss-pdbViewer-4.01和Pymol软件根据蛋白数据库（Proteindatabase，PDB）提供的野生蛋白三维结构模型，构建点突变后突变型蛋白模型，分析突变前后蛋白质空间结构及分子间作用力的改变。
结果
1.先证者1的FⅪ:C降低到13%，FⅪ:Ag含量正常为76%；测序结果发现F11基因的13号外显子存在一个纯合错义点突变c.1562A＞G（p.Tyr503Cys）。先证者的母亲、女儿和儿子携带有该位点的杂合突变，其FⅪ:C均降低至正常值的50%左右，而FⅪ:Ag含量正常；妹妹和配偶的FⅪ:C和FⅪ:Ag含量均正常，基因测序为野生型。
2.先证者2的PC:A和PC:Ag均明显降低，分别为正常对照的39%和45%；测序结果发现PROC基因的9号外显子存在一个杂合错义点突变c.997A＞G（p.Ala291Thr）。先证者二姐和儿子的PROC基因存在相同的突变位点，两者的PC:A和PC:Ag均降低至正常值的50%左右。
3.多序列比对软件ClustalX分析结果表明，F11基因的Tyr503氨基酸残基在同源物种间高度保守，而PROC基因的Ala291氨基酸残基呈弱保守性。PolyPhen-2、PROVEAN和MutationTaster三个生物学软件显示F11基因的p.Tyr503Cys为有害突变，能影响相应蛋白的功能，引起疾病；PolyPhen-2预测PROC基因的p.Ala291Thr为有害突变。FⅪ蛋白模型分析显示，在野生型FⅪ蛋白质中，芳香族Tyr503残基与Leu506及Ile510存在疏水作用力，与Lys554、Ile370主链形成氢键；突变型Cys503的疏水作用力消失，与Lys554、Ile370形成的氢键没有改变，但由于Cys503分子侧链变短，与Lys554侧链又增加了一个氢键。PC蛋白模型分析显示，突变前，Ala291与Pro327之间存在疏水作用力，当Ala291突变成极性亲水的氨基酸Thr291后，其侧链变长，与Pro327之间的疏水作用消失，而二者之间产生一个结合更为牢固的氢键。
结论
1.遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症家系的先证者FⅪ:C降低，FⅪ:Ag含量正常，为Ⅱ型FⅪ缺陷症；先证者F11基因的13号外显子存在纯合c.1562A＞G，导致p.Tyr503Cys错义突变。p.Tyr503Cys与该家系FⅪ水平降低有关。
2.遗传性蛋白C缺陷症家系的先证者，PC:A和PC:Ag均降低，为Ⅰ型蛋白C缺陷症；先证者PROC基因的9号外显子存在杂合c.997A＞G，导致p.Ala291Thr错义突变。p.Ala291Thr与该家系PC水平降低有关。
3.该遗传性凝血因子Ⅺ缺陷症的p.Tyr503Cys错义突变和遗传性蛋白C缺陷症的p.Ala291Thr错义突变均为国内外首次报道。