论文部分内容阅读
目的:探讨大鼠胚胎皮肤成纤维细胞(mouse embryonic skin fibroblasts；MEFB)和人胚胎皮肤成纤维细胞(human embryonic skin fibroblasts；HEFB)的形态结构特征及Ⅰ型胶原(collagenⅠ; Col—Ⅰ)、Ⅲ型胶原(collagenⅢ；Col-Ⅲ)、Smad蛋白的表达特征,为制备研究无瘢痕愈合机制体外培养细胞模型奠定基础。
方法:1.酶消化法体外培养孕14天大鼠MEFB和组织块法培养孕20周HEFB:①培养MEFB:取孕14天大鼠经麻醉后剖腹取出胚胎,取其臀、背部皮肤,75％的酒精消毒、双抗浸泡、生理盐水冲洗、眼科剪机械分离、沉淀、0.25％胰蛋白酶消化、200目不锈钢网滤后离心、含10％胎牛血清培养液37℃、5％CO2培养,6天传代。②培养HEFB:取孕20周胎儿背部皮肤、酒精消毒、双抗浸泡、生理盐水、冲洗、眼科剪机械分离、培养瓶含10％胎牛血清的DMEM培养液37℃、5％CO2培养、6天传代。2.细胞爬片的制备:收集培养的MEFB和HEFB、常规消化传代法接种于置有4％多聚赖氨酸处理盖玻片的6孔培养板,继续培养贴壁至50-80％,4％甲醛固定细胞半小时备用。3.MEFB和HEFB爬片检测:①HE染色观察MEFB和HEFB的形态特征；②透射电镜观察MEFB和HEFB的超微结构；③免疫组织化学(SABC法)量子点标记技术检测MEFB和HEFB内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Smad蛋白的表达；④量子点标记技术检测MEFB和HEFB内Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及Smad蛋白的表达。4.图像分析:Ax-70显微成像系统(OINMPUS)在200-400倍下进行观察及照相,用Image-Pro Plus6.0图像分析系统测定MEFB和HEFB中免疫组化检测Ⅰ、Ⅲ型胶原、Smad蛋白的平均光密度值(average optical density;AOD),和量子点标记技术中Ⅰ、Ⅲ型胶原及Smad蛋白表达的荧光强度值。5.数据统计分析:所得数据均数±标准差((x)±s)表示,采用spss13.0统计软件进行统计学分析,两组比较采用t检验,P<0.05为有显著性差异标准。
结果:①用酶消化法培养MEFB比用组织块培养HEFB,细胞贴壁快,生长速度快。传代后其细胞的生长速度无明显差异,传代5天细胞融合约80％。②HE染色、透射电镜观察结果为典型的成纤维细胞结构。③免疫组织化学检测结果:MEFB中Ⅰ型胶原和HEFB中Ⅰ型胶原图像分析结果显示,两组间AOD比较,无显著性差异(P>0.05)；MEFB中Ⅲ型胶原和HEFB中Ⅲ型胶原图像分析结果显示,两组间AOD比较,无显著性差异(P>0.05);MEFB中的Smad蛋白和HEFB中的Smad蛋白,图像分析结果显示两组AOD比较,无显著性差异(P>0.05)。④量子点荧光技术标记MEFB和HEFB结果:Ⅰ型胶原表达荧光强度两组间比较,无显著性差异(P>0.05);Ⅲ型胶原表达两组间比较,无显著性差异(P>0.05)；Smad蛋白表达两组间比较,无显著性差异(P>0.05)。
结论:①消化培养MEFB和块培养HEFB具有相似的光镜、电镜形态结构。②培养MEFB和HEFB的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原的表达无差异,因此MEFB和HEFB具有相同的功能。③培养MEFB和HEFB的Smad蛋白表达无差异,提示Smad是MEFB和HEFB的Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原表达的相同信号介导途径。④大鼠孕14天胚胎皮肤成纤维细胞具有与人孕20周胚胎皮肤成纤维细胞相似形态结构和功能,因此可以用MEFB取代HEFB作体外实验,进行无瘢痕愈合的进一步深入研究。⑤结合前期在体实验结果,体外培养胚胎成纤维细胞可能成为无瘢痕愈合的在体研究的种子细胞。