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背景与目的
食管鳞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前我国食管癌5年生存率仅约30%。其死亡主要和肿瘤的侵袭、转移密切相关。食管鳞癌的转移起源于在原发灶的侵袭和浸润，主要体现在癌内和癌周淋巴管浸润（lymphaticinvasion，LI）、血管浸润（vascularinvasion，VI）和神经浸润（neuralinvasion，NI）等病理特征上。哪种浸润方式和预后的关系最为密切，特别是在患者尚没有进展到淋巴结或器官转移（N0M0、即stageI和少部分IIA）时，目前尚无定论。
肿瘤细胞既可借血管、淋巴管及神经作为通道的进行扩散和转移（VI、LI、NI），此时，癌旁和癌内固有的血管、淋巴管和神经被视为被动的方式参与肿瘤的侵袭转移，还可以通过微环境，诱导血管新生（angiogenesis）、淋巴管新生（lymphangiogenesis）和轴突新生（axonogenesis），这些方式为它们以相对主动的角色参与肿瘤的发生发展，反过来，血管、淋巴管和神经的新生和重塑也可能促进了LI、VI、NI的发生，它们都是目前研究的热点。
研究食管鳞癌侵袭转移病理特征（NI、LI、VI），寻找有效的量化指标综合评估相对早期的食管鳞癌的侵袭性，对预后预测、临床分期和肿瘤治疗有着较高临床价值。
本研究选用162例未发生淋巴结或器官转移的食管鳞状细胞癌患者（N0M0）的肿瘤标本及其临床随访资料为主要研究对象，采用神经、血管和淋巴管的免疫组化标记，通过观察评分、详细量化、分析和比较癌组织中神经、血管和淋巴管的浸润程度以及血管和淋巴管的富集丰度，以探索一种更有效和更能够反映相对早期的未发生转移的患者食管鳞癌浸润扩散及生存预后的量化评估方法（此时难以使用TNM分期作为预测指标）。另外，下载整理和分析TCGA和GEO的转录组数据，通过生物信息学手段分析肿瘤组织的神经、血管及淋巴管成分的富集含量，并探索这些成分的临床及预后意义。
材料和方法
（1）组织标本汕头大学医学院病理教研室收集的从2008年3月到2013年7月间汕头大学医学院附属肿瘤医院术前未经放化疗且未发生淋巴结或器官转移的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞癌手术标本162例。
（2）临床及预后资料根据前述的组织标本来源，从汕头大学医学院附属肿瘤医院收集整理相应患者临床及预后随访资料。
（3）H&E染色、免疫组织化学和免疫荧光染色对食管鳞癌组织标本切片进行H&E染色、并使用S-100、D2-40和CD31分别对神经、淋巴管和血管进行免疫组化和免疫荧光标记，使用TH和VAChT分别对交感肾上腺素能神经和副交感胆碱能神经进行标记。
（4）建立肿瘤神经、血管及淋巴管浸润和脉管密度的评分方法、对其分数和临床、预后指标做相关性分析。
（5）转录组数据及临床预后资料食管鳞癌转录组数据和临床预后信息下载自TCGA数据库（RNA-seq数据）和GEO数据库（基因组表达谱芯片数据）。
（6）生物信息学方法使用基于ssGSEA算法和xCell工具和ssGSEA算法对神经、血管、淋巴管成分和血管新生表型的富集分数（enrichmentscore）进行计算，并对其进行生存分析。
（7）统计学方法实验数据统计分析采用在R中运行的程序包、GraphPadPrism8.0、MedCalc13.0及MicrosoftExcel2016软件分析处理。显著性标准：P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著地统计学意义。
结果
（1）S-100染色发现神经浸润（NI）阳性率为73.5%，且浸润的神经类型主要为非自主神经。D2-40染色发现癌细胞淋巴管浸润（LI）阳性率为18.5%，CD31染色发现癌组织血管浸润（VI）阳性率为14.2%。
（2）通过建立肿瘤神经浸润、淋巴管浸润和血管浸润的评价标准,得到每个样本神经、淋巴管和血管浸润的各项评分值（即神经的NISC、NII、淋巴管的LISC、LII和血管的VISC、VII）。通过生存分析发现，评分法比阴阳性二分法更有优势。对于没有淋巴结和器官转移（N0M0）的患者，食管鳞癌神经浸润评分（NISC和NII）和患者生存呈负相关（Log-rankP<0.01），且多因素Cox回归NII的HR为6.367(1.274-31.807)，P值为0.024。神经浸润评分对N0M0患者预后的预测效果好于淋巴管和血管浸润（P<0.05）。进一步使用多因素Cox回归模型对生存预测的AUC值可达0.726（P<0.01），做生存曲线，得到Log-rankP<0.0001，HR为3.234。
（3）用转录组数据结合生物信息学方法探索和分析神经、淋巴管和血管在食管鳞癌微环境中的富集，发现血管周细胞（Pericytes）和内皮细胞（Endothelialcells）的富集呈现出与生存负相关（P<0.05）。
结论
（1）通过S-100、CD31、D2-40免疫组化标记评价食管鳞癌神经、淋巴管和血管浸润，发现神经、血管、淋巴管浸润的评分法比阴阳性二分法更有优势。
（2）对于没有淋巴结和器官转移（N0M0）的患者，食管鳞癌神经浸润越严重的患者生存越差，且为一项独立的预后因素。神经浸润评分对没有淋巴结和器官转移患者的预后预测效果好于淋巴管和血管浸润，对其生存预后的意义可能强于淋巴管和血管浸润。
食管鳞癌是我国最常见的恶性肿瘤之一，目前我国食管癌5年生存率仅约30%。其死亡主要和肿瘤的侵袭、转移密切相关。食管鳞癌的转移起源于在原发灶的侵袭和浸润，主要体现在癌内和癌周淋巴管浸润（lymphaticinvasion，LI）、血管浸润（vascularinvasion，VI）和神经浸润（neuralinvasion，NI）等病理特征上。哪种浸润方式和预后的关系最为密切，特别是在患者尚没有进展到淋巴结或器官转移（N0M0、即stageI和少部分IIA）时，目前尚无定论。
肿瘤细胞既可借血管、淋巴管及神经作为通道的进行扩散和转移（VI、LI、NI），此时，癌旁和癌内固有的血管、淋巴管和神经被视为被动的方式参与肿瘤的侵袭转移，还可以通过微环境，诱导血管新生（angiogenesis）、淋巴管新生（lymphangiogenesis）和轴突新生（axonogenesis），这些方式为它们以相对主动的角色参与肿瘤的发生发展，反过来，血管、淋巴管和神经的新生和重塑也可能促进了LI、VI、NI的发生，它们都是目前研究的热点。
研究食管鳞癌侵袭转移病理特征（NI、LI、VI），寻找有效的量化指标综合评估相对早期的食管鳞癌的侵袭性，对预后预测、临床分期和肿瘤治疗有着较高临床价值。
本研究选用162例未发生淋巴结或器官转移的食管鳞状细胞癌患者（N0M0）的肿瘤标本及其临床随访资料为主要研究对象，采用神经、血管和淋巴管的免疫组化标记，通过观察评分、详细量化、分析和比较癌组织中神经、血管和淋巴管的浸润程度以及血管和淋巴管的富集丰度，以探索一种更有效和更能够反映相对早期的未发生转移的患者食管鳞癌浸润扩散及生存预后的量化评估方法（此时难以使用TNM分期作为预测指标）。另外，下载整理和分析TCGA和GEO的转录组数据，通过生物信息学手段分析肿瘤组织的神经、血管及淋巴管成分的富集含量，并探索这些成分的临床及预后意义。
材料和方法
（1）组织标本汕头大学医学院病理教研室收集的从2008年3月到2013年7月间汕头大学医学院附属肿瘤医院术前未经放化疗且未发生淋巴结或器官转移的食管鳞状细胞癌患者的食管鳞癌手术标本162例。
（2）临床及预后资料根据前述的组织标本来源，从汕头大学医学院附属肿瘤医院收集整理相应患者临床及预后随访资料。
（3）H&E染色、免疫组织化学和免疫荧光染色对食管鳞癌组织标本切片进行H&E染色、并使用S-100、D2-40和CD31分别对神经、淋巴管和血管进行免疫组化和免疫荧光标记，使用TH和VAChT分别对交感肾上腺素能神经和副交感胆碱能神经进行标记。
（4）建立肿瘤神经、血管及淋巴管浸润和脉管密度的评分方法、对其分数和临床、预后指标做相关性分析。
（5）转录组数据及临床预后资料食管鳞癌转录组数据和临床预后信息下载自TCGA数据库（RNA-seq数据）和GEO数据库（基因组表达谱芯片数据）。
（6）生物信息学方法使用基于ssGSEA算法和xCell工具和ssGSEA算法对神经、血管、淋巴管成分和血管新生表型的富集分数（enrichmentscore）进行计算，并对其进行生存分析。
（7）统计学方法实验数据统计分析采用在R中运行的程序包、GraphPadPrism8.0、MedCalc13.0及MicrosoftExcel2016软件分析处理。显著性标准：P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著地统计学意义。
结果
（1）S-100染色发现神经浸润（NI）阳性率为73.5%，且浸润的神经类型主要为非自主神经。D2-40染色发现癌细胞淋巴管浸润（LI）阳性率为18.5%，CD31染色发现癌组织血管浸润（VI）阳性率为14.2%。
（2）通过建立肿瘤神经浸润、淋巴管浸润和血管浸润的评价标准,得到每个样本神经、淋巴管和血管浸润的各项评分值（即神经的NISC、NII、淋巴管的LISC、LII和血管的VISC、VII）。通过生存分析发现，评分法比阴阳性二分法更有优势。对于没有淋巴结和器官转移（N0M0）的患者，食管鳞癌神经浸润评分（NISC和NII）和患者生存呈负相关（Log-rankP<0.01），且多因素Cox回归NII的HR为6.367(1.274-31.807)，P值为0.024。神经浸润评分对N0M0患者预后的预测效果好于淋巴管和血管浸润（P<0.05）。进一步使用多因素Cox回归模型对生存预测的AUC值可达0.726（P<0.01），做生存曲线，得到Log-rankP<0.0001，HR为3.234。
（3）用转录组数据结合生物信息学方法探索和分析神经、淋巴管和血管在食管鳞癌微环境中的富集，发现血管周细胞（Pericytes）和内皮细胞（Endothelialcells）的富集呈现出与生存负相关（P<0.05）。
结论
（1）通过S-100、CD31、D2-40免疫组化标记评价食管鳞癌神经、淋巴管和血管浸润，发现神经、血管、淋巴管浸润的评分法比阴阳性二分法更有优势。
（2）对于没有淋巴结和器官转移（N0M0）的患者，食管鳞癌神经浸润越严重的患者生存越差，且为一项独立的预后因素。神经浸润评分对没有淋巴结和器官转移患者的预后预测效果好于淋巴管和血管浸润，对其生存预后的意义可能强于淋巴管和血管浸润。