【摘 要】
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目的:1.应用转化生长因子-β2（transforming growth factor,TGF-β2）诱导人来源的晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）发生间质化转变,构建间质化细胞模型,检测晶状体上皮细胞中长链非编码RNA结肠癌相关转录本1（Long non-coding RNA colon cancer-associated transcript-
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目的:1.应用转化生长因子-β2（transforming growth factor,TGF-β2）诱导人来源的晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,HLECs）发生间质化转变,构建间质化细胞模型,检测晶状体上皮细胞中长链非编码RNA结肠癌相关转录本1（Long non-coding RNA colon cancer-associated transcript-1,lncRNA CCAT1）的表达量。2.敲低CCAT1的表达,检测各分子水平间质化标志物的表达量的变化。3.探讨C CAT1在TGF-β2诱导的HLECs的间质化过程中的作用。方法:本实验以TGF-β2诱导HLECs永生系SRA01/04细胞发生间质化,建立间质化细胞模型。含有10ng/ml TGF-β2的低糖DMEM培养液培养SRA01/04细胞48小时作为实验组,以普通低糖DMEM培养基培养SRA01/04细胞作空白对照组。利用倒置显微镜观察细胞的形态学变化,通过实时荧光定量PCR以及Western blot法检测lncRNA CCAT1以及上皮间质转化标志物的相对表达量的变化。采用小干扰RNA（si RNA）沉默CCAT1的表达,采用实时荧光定量PCR以及Western blot法检测lncRNA CCAT1以及上皮间质转化标志物的相对表达量的变化。探讨LncRNA CCAT1在TGF-β2诱导的HLECs间质化过程中的作用及其对PCO形成的影响。结果:1.TGF-β2诱导人晶状体SRA01/04细胞,成功构建间质化细胞模型。倒置显微镜下,实验组细胞形态由多边形变为长梭形。实时荧光定量PCR以及western blot法检测发现,与空白对照组相比较,实验组上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白（E-cadh erin）表达明显降低（p＜0.05）,间质细胞标志物波形蛋白（vimentin）（p＜0.05）,α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）（p＜0.05）表达量明显增加,差异有统计学意义。荧光显微镜下发现,与空白对照组相比较,实验组晶状体上皮细胞内α-SMA蛋白以及波形蛋白表达量增加,荧光强度增加,同时细胞形态呈现间质化转变。实时荧光定量PCR检测不同浓度的TGF-β2因子对lncRNA CCAT1表达的影响,发现CCA T1的表达具有浓度依赖性,随着TGF-β2浓度的增加,CCAT1的表达量增加,10ng/ml时CCAT1的表达提高最为明显,所以选用10ng/ml作为处理浓度进行后续实验。2.成功筛选出高效率沉默CCAT1表达的si CCAT1,实时荧光定量PCR结果显示,si CC AT1-1,si CCAT1-2,si CCAT1-3均可沉默CCAT1的表达,但si CCAT1-2的干扰效果最明显,最终我们选择si CCAT1-2进行后续实验。3.运用实时荧光定量PCR以及w estern blot法检测不同CCAT1表达水平下上皮细胞标志蛋白E-钙黏蛋白,以及间质细胞标志蛋白波形蛋白,α-平滑肌肌动蛋白的表达变化。结果发现:与si NC组（标记为NC组）相比,经TGF-β2处理的si NC（标记为Tnc）,波形蛋白,α-平滑肌肌动蛋白的表达量增加（P＜0.05）,E-钙黏蛋白的表达量降低（P＜0.05）,差异有统计学意义。与Tnc组相比,TGF-β2处理的si CCAT1敲低实验组（标记为Tl nc组）,波形蛋白,α-平滑肌肌动蛋白的表达量降低（P＜0.05）,E-钙黏蛋白的表达量增加（P＜0.05）,差异有统计学意义。结论:LncRNA CCAT1参与TGF-β2诱导的HLECs间质化过程;沉默LncRNA CCAT1的表达,可逆转TGF-β2引起的HLECs间质化进程。
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