【摘 要】
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肝素酶Ⅰ（Heparinase, Hep I）是一类作用于肝素类糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）主链糖苷键的多糖裂解酶，可用于低分子量肝素的制备、肝素类物质结构的解析及体外血液循环中残存肝素的清除。2008年的肝素钠事件对肝素类药物的安全性提出了更高的要求，因此需要严格控制LMWH制备过程中工具酶HepⅠ的纯度，此外高纯度的HepⅠ也更有利于后续对酶的晶体结构进行研究。本文拟
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肝素酶Ⅰ（Heparinase, Hep I）是一类作用于肝素类糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）主链糖苷键的多糖裂解酶，可用于低分子量肝素的制备、肝素类物质结构的解析及体外血液循环中残存肝素的清除。2008年的肝素钠事件对肝素类药物的安全性提出了更高的要求，因此需要严格控制LMWH制备过程中工具酶HepⅠ的纯度，此外高纯度的HepⅠ也更有利于后续对酶的晶体结构进行研究。本文拟通过分子克隆手段构建在HepⅠ基因上游携带GST-His双标签的重组表达载体pGEX-His-HepⅠ，以期获得高表达量和高纯度的HepⅠ，为制备高安全性的LMWH和HepⅠ晶体结构的解析奠定了基础。 以pET15b-HepⅠ为模板，通过PCR技术扩增出上游携带6×His标签的HeparinaseⅠ基因，与pMD-19T simple vector连接后，成功构建了重组克隆质粒pMD-19T-His-HepⅠ。经PCR、双酶切和测序鉴定后，用限制性内切酶Bam H I和Sal I双酶切重组克隆质粒pMD-19T-His-HepⅠ和表达载体pGEX-4T-1，构建重组表达质粒pGEX-4T-1-His-HepⅠ。对重组表达质粒pGEX-4T-1-His-HepⅠ进行PCR、双酶切，条带大小与理论值相符，且测序结果显示与设计序列完全一致。 在含有100mL LB培养基的500mL摇瓶中，采用单因素方法对重组工程菌的最佳培养条件和诱导条件进行摸索，所得最佳摇瓶发酵诱导条件为：发酵液初始pH7.4，500mL摇瓶装液量80mL，二级种子液接种量为2%条件下，37℃培养6h（OD600为1.6）时添加0.8mmol/L的IPTG，22℃诱8h，重组工程菌的菌体生长量DCW值和产酶水平均相对较高，分别为0.973g/L和418.63IU/L。在摇瓶优化的基础上，考察重组工程菌在5L发酵罐中的高密度发酵情况。5L发酵罐中对诱导时机和碳源进行了优化的结果表明：以甘油为碳源在菌体生长的对数中期诱导，更有利于GST-His-HepⅠ融合蛋白的表达，菌体生长量OD600值和粗酶液活性分别为122.14和1.697×104IU/L。 上清液经GSTrap FF和HisTrap HP柱两步亲和纯化，所得产物经SDS-PAGE检测，在66kDa和43kDa处显示特异条带，分别与GST-His-HepⅠ和His-HepⅠ融合蛋白预期分子量相符；最终His-HepⅠ融合蛋白的比酶活为86.45IU/mg，纯度高达99%，与仅一步亲和纯化得到的GST-His-HepⅠ融合蛋白相比，进一步提高了纯化后重组肝素酶的纯度。纯化后HepⅠ的酶学特性的初步研究结果表明：两种酶降解肝素的最适反应温度和最适pH均是30℃和pH7.0，且两种酶的热稳定都比较差，但pH稳定性均较好，在pH7.0-10的范围内4℃静置30min活性基本没有损失。此外4种不同酶保护剂对酶活性的影响结果表明：BSA（0.1%），TW80（0.001mmol/L），CaCl2（1mmol/L）和DTT（0.5mmol/L）对HepⅠ分子结构的稳定和活性的保持均能产生积极的保护作用。重组HepⅠ裂解肝素所得产物的GPC-MASS结果表明：GST-His-HepⅠ和His-HepⅠ融合蛋白均能很好的裂解肝素，裂解产物的平均分子量均在7000Da左右，它们具有类似的催化活性和底物特异性。
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