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目的：
(1)观察补阳还五汤四种抗氧化单体成分环黄芪醇(Cycloastragenol, CAG)、羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A)、羟基芍药苷(Oxypaeoniflorin)、扁桃苷(Amygdalin)对破骨细胞(osteoclast, OC)分化，成骨细胞(osteoblast, OB)分化，微血管内皮细胞(microvascular endothelial cell, MVEC)迁移和损伤能否产生多元调控作用。从抗氧化角度研究单体成分抑制OC形成和骨吸收功能的分子机制，并在小鼠体内验证单体成分抑制过度骨吸收的作用。
(2)观察单体成分对大鼠糖皮质激素性股骨头坏死(glucocorticoid induced osteonecrosis of femoral head, GIONFH)骨修复的作用，并从多元调控角度探讨其中牵涉的作用机制。
方法：
(1)第一部分：从C57BL/6J小鼠分离培养骨髓巨噬细胞(bone marrow derive macrophages, BMMs)，并以巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)和核因子-κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand,RANKL)诱导OC分化。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAcP)染色观察四种单体成分在同等浓度下对OC分化的影响。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色观察四种单体成分在同等浓度下对MC3T3-E1小鼠OB前体细胞成骨分化的影响；在SV40猿猴病毒转化小鼠微血管内皮细胞(a simian virus 40-transformed mouse microvascular endothelial cell line, SVEC)观察不同单体成分在同等药物浓度下对MVEC迁移和脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导损伤的影响。在药物筛选的基础上，探讨抗氧化单体成分抑制OC分化和骨吸收功能的分子机制。通过MTS法确定单体成分对小鼠BMMs增殖能力的影响。通过TRAcP染色确定单体成分抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化的作用浓度以及对OC不同分化阶段的作用。通过免疫荧光染色观察单体成分对RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中肌动蛋白环(F-actin ring)形成的影响。通过羟基磷灰石的骨吸收实验确定单体成分对RANKL诱导的OC骨吸收功能的影响。通过稳定转染的RAW264.7小鼠OC前体细胞构建荧光素酶报告基因，观察单体成分干预对RANKL诱导的活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)、核因子-κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)、抗氧化反应元件(anti-oxidative response element, ARE)转录活性的影响。通过qPCR检测单体成分干预对RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中OC形成和骨吸收功能相关基因以及抗氧化酶相关基因表达的影响。通过Westernblot检测单体成分干预对RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中Nrf2/Keap1/ARE、MAPK、NF-κB、Ca2+通路以及OC形成关键蛋白表达的影响，并在RAW264.7小鼠OC前体细胞验证OC形成关键蛋白的表达情况。通过钙离子震荡实验，观察单体成分干预对RANKL诱导的BMMs向OC分化过程中钙离子内流的影响。在C57BL/6J小鼠体内观察单体成分干预对股骨远端骨吸收的影响。
(2)第二部分：通过臀肌注射甲泼尼龙(20mg/kg，每周第1-3天，第1-3周，共干预9次，总剂量180mg/kg)在SD大鼠诱导GIONFH，同时分别以不同剂量(5mg/kg和15mg/kg)单体成分干预GIONFH，之后停止干预3周，第6周时每组随机选择大鼠进行硫酸钡血管心脏灌注，并对所有大鼠双侧下肢骨组织取材，通过Micro-CT扫描重建获得股骨头血管造影情况以及骨骺线上下两个感兴趣区域(region of interest, ROI)的骨参数，从而确定单体成分干预对GIONFH骨修复的作用。通过Westernblot检测单体成分对GIONFH大鼠骨组织内低氧、骨形成、骨吸收和血管化相关蛋白表达的影响。
结果：
(1)通过TRAcP染色发现，环黄芪醇能够在5和10μM时显著抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化。通过ALP染色发现，10μM环黄芪醇抑制MC3T3-E1的成骨分化。10μM环黄芪醇未明显影响MVEC的迁移和LPS诱导的MVEC的损伤。通过MTS检测和TRAcP染色发现，1-10μM环黄芪醇能够在不影响BMMs增殖的情况下，剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化，这种抑制作用在OC分化早期最强，中期次之，晚期则无明显影响。通过免疫荧光观察发现，5和10μM环黄芪醇剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中肌动蛋白环的形成和细胞核聚集数量。通过羟基磷灰石骨吸收实验发现，5和10μM环黄芪醇能够剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs所形成的OC的骨吸收能力。通过qPCR发现，5和10μM环黄芪醇能够剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中OC形成相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(Acp5)、原癌基因c-fos、活化T细胞核因子1(Nfatc1)和OC骨吸收相关基因ATP酶H+转运溶酶体辅助蛋白2(Atp6v0d2)、组织蛋白酶K(Ctsk)、基质金属蛋白酶9(Mmp9)、降钙素受体(Calcr)的表达，同时提高抗氧化相关基因过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GSR)、血红素加氧酶1(HMOX-1)、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、醌氧化还原酶1(Nqo1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、硫氧还蛋白-1(Trx1)、沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)、Sirt3的表达，并上调Nrf2/Keap1比值。荧光素酶报告基因实验显示,2.5、5和10μM环黄芪醇能够在不同时间点剂量依赖地抑制RANKL激活的NFAT、NF-κB的转录活性，同时提高ARE的转录活性。Westernblot显示，10μM环黄芪醇干预可以显著降低RANKL诱导的BMMs和RAW264.7向OC分化中OC形成的关键蛋白c-Fos和NFATc1的表达，同时提高了RANKL诱导的BMMs向OC分化过程中抗氧化酶相关蛋白血红素加氧酶1(HO-1)、SOD2及TRX1的表达，此外10μM环黄芪醇干预降低了RANKL诱导的BMMs向OC分化早期细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白的磷酸化水平和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的早期降解，并部分降低了钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶4(CaMKIV)的磷酸化水平。通过钙离子震荡实验发现，10μM环黄芪醇显著抑制RANKL诱导的BMMs向OC分化过程中钙离子内流。通过Micro-CT扫描发现，10mg/kg环黄芪醇可显著抑制小鼠股骨远端发生的过度骨吸收。综上来看，环黄芪醇促进了Nrf2/Keap1/ARE通路转录水平以及抗氧化酶相关基因和蛋白的表达，同时抑制了MAPK、NF-κB、钙离子通路的活性，从而降低了OC形成和骨吸收功能相关基因和蛋白的表达，是环黄芪醇抑制OC分化和骨吸收的潜在分子机制。
(2)在大鼠GIONFH造模过程中，高剂量环黄芪醇干预组一只大鼠在第三周造模结束后发生死亡，发现后立即对该大鼠的股骨头进行Micro-CT扫描，发现股骨头内发生了骨结构损害。其余27只大鼠完成实验全程，期间观察到甲泼尼龙干预的大鼠体重持续下降，停止干预后大鼠体重逐步上升。通过硫酸钡血管造影发现甲泼尼龙诱导的GIONFH大鼠股骨头内血供受损，但未能在高剂量环黄芪醇干预组成功进行血管造影。通过比较大鼠股骨头内骨骺线上下方两个ROI的骨参数发现，环黄芪醇能够剂量依赖地促进GIONFH大鼠股骨头内不同区域的骨修复。Westernblot显示，模型组大鼠骨组织中低氧相关蛋白低氧诱导因子1α(HIF-1α)，骨形成相关蛋白Ⅱ型胶原纤维α1(COL2A1)、Ⅰ型胶原α(COL1A)、β-连环蛋白(β-Catenin)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨桥蛋白(OPN)，血管形成相关蛋白血管内皮生长因子A(VEGFA)，骨吸收相关蛋白MMP9和CTSK的蛋白表达受到不同程度的影响，环黄芪醇干预能够剂量依赖地调节上述蛋白表达。综上来看，环黄芪醇干预后股骨头内低氧环境得到改善，成骨、破骨、血管化相关的蛋白表达受到调控，可能是环黄芪醇促进GIONFH骨修复的潜在机制。
结论：
环黄芪醇能够通过抗氧化作用抑制RANKL诱导的OC形成和骨吸收功能，并通过多元调控作用促进大鼠GIONFH的骨修复。
(1)观察补阳还五汤四种抗氧化单体成分环黄芪醇(Cycloastragenol, CAG)、羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A)、羟基芍药苷(Oxypaeoniflorin)、扁桃苷(Amygdalin)对破骨细胞(osteoclast, OC)分化，成骨细胞(osteoblast, OB)分化，微血管内皮细胞(microvascular endothelial cell, MVEC)迁移和损伤能否产生多元调控作用。从抗氧化角度研究单体成分抑制OC形成和骨吸收功能的分子机制，并在小鼠体内验证单体成分抑制过度骨吸收的作用。
(2)观察单体成分对大鼠糖皮质激素性股骨头坏死(glucocorticoid induced osteonecrosis of femoral head, GIONFH)骨修复的作用，并从多元调控角度探讨其中牵涉的作用机制。
方法：
(1)第一部分：从C57BL/6J小鼠分离培养骨髓巨噬细胞(bone marrow derive macrophages, BMMs)，并以巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor, M-CSF)和核因子-κB受体活化因子配体(receptoractivatorofnuclearfactor-κBligand,RANKL)诱导OC分化。通过抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAcP)染色观察四种单体成分在同等浓度下对OC分化的影响。通过碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)染色观察四种单体成分在同等浓度下对MC3T3-E1小鼠OB前体细胞成骨分化的影响；在SV40猿猴病毒转化小鼠微血管内皮细胞(a simian virus 40-transformed mouse microvascular endothelial cell line, SVEC)观察不同单体成分在同等药物浓度下对MVEC迁移和脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)诱导损伤的影响。在药物筛选的基础上，探讨抗氧化单体成分抑制OC分化和骨吸收功能的分子机制。通过MTS法确定单体成分对小鼠BMMs增殖能力的影响。通过TRAcP染色确定单体成分抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化的作用浓度以及对OC不同分化阶段的作用。通过免疫荧光染色观察单体成分对RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中肌动蛋白环(F-actin ring)形成的影响。通过羟基磷灰石的骨吸收实验确定单体成分对RANKL诱导的OC骨吸收功能的影响。通过稳定转染的RAW264.7小鼠OC前体细胞构建荧光素酶报告基因，观察单体成分干预对RANKL诱导的活化T细胞核因子(nuclear factor of activated T cells, NFAT)、核因子-κB(nuclearfactorkappa-B,NF-κB)、抗氧化反应元件(anti-oxidative response element, ARE)转录活性的影响。通过qPCR检测单体成分干预对RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中OC形成和骨吸收功能相关基因以及抗氧化酶相关基因表达的影响。通过Westernblot检测单体成分干预对RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中Nrf2/Keap1/ARE、MAPK、NF-κB、Ca2+通路以及OC形成关键蛋白表达的影响，并在RAW264.7小鼠OC前体细胞验证OC形成关键蛋白的表达情况。通过钙离子震荡实验，观察单体成分干预对RANKL诱导的BMMs向OC分化过程中钙离子内流的影响。在C57BL/6J小鼠体内观察单体成分干预对股骨远端骨吸收的影响。
(2)第二部分：通过臀肌注射甲泼尼龙(20mg/kg，每周第1-3天，第1-3周，共干预9次，总剂量180mg/kg)在SD大鼠诱导GIONFH，同时分别以不同剂量(5mg/kg和15mg/kg)单体成分干预GIONFH，之后停止干预3周，第6周时每组随机选择大鼠进行硫酸钡血管心脏灌注，并对所有大鼠双侧下肢骨组织取材，通过Micro-CT扫描重建获得股骨头血管造影情况以及骨骺线上下两个感兴趣区域(region of interest, ROI)的骨参数，从而确定单体成分干预对GIONFH骨修复的作用。通过Westernblot检测单体成分对GIONFH大鼠骨组织内低氧、骨形成、骨吸收和血管化相关蛋白表达的影响。
结果：
(1)通过TRAcP染色发现，环黄芪醇能够在5和10μM时显著抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化。通过ALP染色发现，10μM环黄芪醇抑制MC3T3-E1的成骨分化。10μM环黄芪醇未明显影响MVEC的迁移和LPS诱导的MVEC的损伤。通过MTS检测和TRAcP染色发现，1-10μM环黄芪醇能够在不影响BMMs增殖的情况下，剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化，这种抑制作用在OC分化早期最强，中期次之，晚期则无明显影响。通过免疫荧光观察发现，5和10μM环黄芪醇剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中肌动蛋白环的形成和细胞核聚集数量。通过羟基磷灰石骨吸收实验发现，5和10μM环黄芪醇能够剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs所形成的OC的骨吸收能力。通过qPCR发现，5和10μM环黄芪醇能够剂量依赖地抑制RANKL诱导的BMMs破骨分化过程中OC形成相关基因抗酒石酸酸性磷酸酶(Acp5)、原癌基因c-fos、活化T细胞核因子1(Nfatc1)和OC骨吸收相关基因ATP酶H+转运溶酶体辅助蛋白2(Atp6v0d2)、组织蛋白酶K(Ctsk)、基质金属蛋白酶9(Mmp9)、降钙素受体(Calcr)的表达，同时提高抗氧化相关基因过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽还原酶(GSR)、血红素加氧酶1(HMOX-1)、Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)、醌氧化还原酶1(Nqo1)、超氧化物歧化酶1(SOD1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)、硫氧还蛋白-1(Trx1)、沉默信息调节因子2相关酶1(Sirt1)、Sirt3的表达，并上调Nrf2/Keap1比值。荧光素酶报告基因实验显示,2.5、5和10μM环黄芪醇能够在不同时间点剂量依赖地抑制RANKL激活的NFAT、NF-κB的转录活性，同时提高ARE的转录活性。Westernblot显示，10μM环黄芪醇干预可以显著降低RANKL诱导的BMMs和RAW264.7向OC分化中OC形成的关键蛋白c-Fos和NFATc1的表达，同时提高了RANKL诱导的BMMs向OC分化过程中抗氧化酶相关蛋白血红素加氧酶1(HO-1)、SOD2及TRX1的表达，此外10μM环黄芪醇干预降低了RANKL诱导的BMMs向OC分化早期细胞外调节蛋白激酶(ERK)蛋白的磷酸化水平和NF-κB抑制蛋白α(IκBα)的早期降解，并部分降低了钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶4(CaMKIV)的磷酸化水平。通过钙离子震荡实验发现，10μM环黄芪醇显著抑制RANKL诱导的BMMs向OC分化过程中钙离子内流。通过Micro-CT扫描发现，10mg/kg环黄芪醇可显著抑制小鼠股骨远端发生的过度骨吸收。综上来看，环黄芪醇促进了Nrf2/Keap1/ARE通路转录水平以及抗氧化酶相关基因和蛋白的表达，同时抑制了MAPK、NF-κB、钙离子通路的活性，从而降低了OC形成和骨吸收功能相关基因和蛋白的表达，是环黄芪醇抑制OC分化和骨吸收的潜在分子机制。
(2)在大鼠GIONFH造模过程中，高剂量环黄芪醇干预组一只大鼠在第三周造模结束后发生死亡，发现后立即对该大鼠的股骨头进行Micro-CT扫描，发现股骨头内发生了骨结构损害。其余27只大鼠完成实验全程，期间观察到甲泼尼龙干预的大鼠体重持续下降，停止干预后大鼠体重逐步上升。通过硫酸钡血管造影发现甲泼尼龙诱导的GIONFH大鼠股骨头内血供受损，但未能在高剂量环黄芪醇干预组成功进行血管造影。通过比较大鼠股骨头内骨骺线上下方两个ROI的骨参数发现，环黄芪醇能够剂量依赖地促进GIONFH大鼠股骨头内不同区域的骨修复。Westernblot显示，模型组大鼠骨组织中低氧相关蛋白低氧诱导因子1α(HIF-1α)，骨形成相关蛋白Ⅱ型胶原纤维α1(COL2A1)、Ⅰ型胶原α(COL1A)、β-连环蛋白(β-Catenin)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨桥蛋白(OPN)，血管形成相关蛋白血管内皮生长因子A(VEGFA)，骨吸收相关蛋白MMP9和CTSK的蛋白表达受到不同程度的影响，环黄芪醇干预能够剂量依赖地调节上述蛋白表达。综上来看，环黄芪醇干预后股骨头内低氧环境得到改善，成骨、破骨、血管化相关的蛋白表达受到调控，可能是环黄芪醇促进GIONFH骨修复的潜在机制。
结论：
环黄芪醇能够通过抗氧化作用抑制RANKL诱导的OC形成和骨吸收功能，并通过多元调控作用促进大鼠GIONFH的骨修复。