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为了实现生物体液中氨基酸的直接进样毛细管电泳(CE)分析,本文开展了系统的研究,先后发展了在线酸滴定抗盐聚焦和微量手性样品在线衍生CE方法。
为克服生物体液样品中的高盐成分对痕量组分分析的干扰,以氨基酸为模型化合物,发展了在线酸滴定抗盐富集方法。该方法将阴离子分析物和酸顺序引入毛细管并令其发生酸碱反应,反应后分析物的电泳淌度降低,可不断地聚集在酸碱反应的界面附近,即出现堆积现象。实验结果表明,该方法可以实现含盐样品的直接进样,盐浓度高达500mmol/L而不影响分离效率,富集倍数最高可达1000倍,紫外检测限可降低到10-8mol/L。利用该方法,对鼠脑脊液、血清和人体唾液中兴奋性氨基酸进行了检测,分析结果与文献值相符。在此基础上,进一步发展了大体积样品的强酸滴定富集方法。该方法利用电泳原理使强酸进入毛细管并与事先引入毛细管中的弱阴离子发生中和反应,消除了弱酸滴定的选择性富集问题。为了进一步提高样品的进样量,在酸滴定过程中添加了一个反压来抵抗电渗流的作用,使最大进样量提高了2倍左右。
为了分析微量的手性样品,我们仍然以氨基酸为模型化合物,发展了在线衍生—手性CE方法。该方法首先利用压力将样品、缓冲液和FMOC标记试剂依次引入毛细管中,然后利用电压使之混合并反应,再令反应产物进入二元手性选择剂系统中进行电泳分离,最后通过紫外吸收检测获得峰信息。该法可成功标记并拆分19对常见的手性氨基酸对映异构体,其中有17对氨基酸达到基线分离(Rs=1.73-5.79),另外2对氨基酸部分分离(Ala,Rs=0.39,Arg,Rs=1.15)。与离线衍生相比,该在线衍生方法能基本保持CE分离度,仅有少数氨基酸的分离度略有下降:其紫外检测限亦基本保持不变,可以达到4.0μmol/L。该方法成功地用于血清样品中一些氨基酸的定量测定。