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光合碳固定是地球上非常重要的生化过程,RuBisCO酶是该过程的基石,而RuBisCO另一个身份——Rubp加氧酶引起的光呼吸则严重限制了光合碳固定。植物中以C4和CAM光合途径为代表的碳浓缩机制能够提高细胞内CO2浓度从而促进光合碳固定。在水生高等植物中还存在着利用重碳酸盐、兼性C4/CAM途径等独特的碳浓缩机制。PEPC在这些碳浓缩机制中发挥关键的作用。多项研究发现多数陆生C4植物科属中rbcL基因和ppc基因家族都经历了明显的适应性进化,不同起源的C4植物在rbcL和ppc的一些关键位点发生了大规模的趋同进化。C4植物光合型ppc基因起源于非光合型的ppc基因,正选择在其新功能的进化过程中起到了关键作用。而对于CAM和水生植物的碳浓缩机制,相关的研究则相对较少。考察编码RuBisCO大亚基的rbcL基因和编码PEPC的ppc基因家族在具有CAM和其他碳浓缩机制的植物中的进化可以为全面地理解植物多样的碳浓缩机制的起源和进化提供理论支持。 本研究采用了PAML软件包中的codeML程序对多个包含CAM植物的植物类群和具有独特碳浓缩机制的水生植物类群的rbcL和ppc基因(家族)进行了适应性进化分析。 1)对CAM植物分布较多的水韭属、风梨科、景天科、仙人掌科、书带木属、石斛属和水生植物分布较多的水鳖科多种植物的rbcL基因数据进行了分析,结果表明:在这些物种的rbcL基因中净化选择占主导,似然比检验显示在水韭属、凤梨科、景天科、书带木属、石斛属中位点模型中的正选择模型M2a和M8都被接受,并检测到了数个正选择位点。而在仙人掌科植物中正选择模型并没有被接受,意味着作用于仙人掌科植物rbcL基因上的正选择较弱。在水鳖科植物rbcL基因中M2a和M8模型检测到一个可能的正选择位点309I,这个位点也是多数C4植物rbcL基因所共有的一个正选择位点。而在这些物种的rbcL基因中,分支位点模型在将具有碳浓缩机制的物种设为前景支的情况下都没有检测到显著的正选择位点。在水鳖科植物rbcL基因中,以沉水植物作为前景支的分支位点模型通过了似然比检验,但是没有检测到显著的正选择位点;而以浮叶植物作为前景支的分支位点模型择则没有被似然比检验接受。说明水生生境相对于气生生境对rbcL基因的选择作用更强。 2)对水鳖科、书带木属和伽蓝菜属多种植物的ppc基因家族进行了适应性进化分析,结果显示在这些植物的ppc基因家族中,净化选择占主导。位点模型和分支位点模型在这三组ppc基因家族中都没有检测到显著的正选择位点。 3)种种证据表明,水鳖科沉水植物埃格草具有非常独特的碳浓缩机制:可诱导、具有兼性C4途径的特征。而我们并没有在水鳖科ppc基因家族中检测到适应性进化。我们对埃格草进行了低CO2处理,并利用realtime qPCR、酶学实验及蛋白印迹实验在茎叶中检测了ppc家族成员在低CO2诱导过程的表达变化和PEPC活性变化。我们成功地获得了埃格草5条植物型ppc基因(plant-type ppc)和一条细菌型ppc基因(bacteria-type ppc)的部分片段。在其中四个植物型ppc亚型中获得了全长开放阅读框。所获得的水鳖科植物ppc序列中都没有发现C4标志性的氨基酸残基。Realtime qPCR实验结果表明:在高[CO2]处理组,茎和叶片中的EdPEPC各个亚型相对于内参EdActin的相对表达量都比较低。在低[CO2]处理组中EdPEPC1表达明显上调了,在叶片中大概上调了40倍,而在茎中则上调了近140倍。EdPEPC1这个亚型很有可能是其响应低CO2胁迫的光合型亚型。酶活性实验和蛋白印迹实验也表明经过低[CO2]处理,EdPEPC1的表达量和活性也相应地升高了。另外我们还意外地发现,埃格草的茎也参与到了其独特的无机碳浓缩机制中。