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木质纤维素生物质是地球上最为丰富的可再生资源，是供应第二代生物燃料和生物精炼产品生产的理想原料，但原料的降解顽固性使生物技术转化复杂且成本高。丝状真菌里氏木霉由于具有强大的蛋白合成分泌能力受到人们的关注，其突变株能够产生多达100g/L的富含纤维素酶的胞外蛋白，这使其成为工业中生产酶制剂和重组蛋白的良好宿主。然而，木霉分泌的纤维素酶系中纤维素外切酶和内切酶占比很高，而β-葡萄糖苷酶和半纤维素酶占比较低，这限制了其酶系对木质纤维素底物降解效率的进一步提高。
目前对里氏木霉高效蛋白合成机理的研究主要集中在基因转录环节，而对分泌途径研究较少，限制了基于合成分泌机理的遗传改造以进一步提高内源/异源蛋白表达水平。内质网易位是分泌型蛋白高效合成的首要环节，低效的内质网易位会极大地降低蛋白的产量。虽然经典理论认为内质网锚定由信号识别颗粒蛋白SRP通过识别蛋白N端信号肽介导完成，但是有研究发现其它物种中内质网锚定存在着非SRP依赖方式。作为丝状真菌中的模式菌株，SRP在里氏木霉蛋白高效合成分泌中的作用值得探讨，这有助于揭示未知的内质网高效锚定方式，促进丝状真菌蛋白表达细胞工厂的构建和应用。
本论文主要包括两个方面的研究，一方面是基于(半)纤维素酶转录调控机理，采用菌株改造策略来优化重构里氏木霉胞外纤维素降解酶系;另一方面对SRP复合物重要亚基在里氏木霉中的功能进行探究。主要研究工作总结如下:
一、构建了一株主要纤维素酶基因缺失及转录激活调控因子XYR1过表达的△5677OExyr1菌株。该菌株在葡萄糖和乳糖碳源下的胞外酶系组成较野生型菌株QM9414发生显著变化，具有较高水平的葡萄糖苷酶和多种半纤维素酶酶活，能够有效促进木质纤维素底物中半纤维素的降解。
以纤维素内切酶CEL5A和CEL7B及外切酶CEL6A和CEL7A同时缺失的△5677菌株为出发菌株，使用tcu1强启动子对转录激活因子XYR1进行过表达，发现该菌株在葡萄糖和乳糖碳源下胞外酶谱发生明显变化，具有高水平的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等酶活，胞外蛋白的质谱鉴定发现BGL1、XYN3和MAN5A等(半)纤维素酶以及CIP、Swollenin等降解辅助蛋白表达水平上调。在乳糖培养条件下，该菌株胞外酶系中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的表达水平也明显提高，其酶活较野生型QM9414提高10倍，达到8U/mL。菌株△5677OExyr1在葡萄糖和乳糖条件下的胞外发酵液均可以显著促进复杂底物玉米皮中半纤维素类物质的释放。
二、在第一章构建的△5677OExyr1菌株中，以cbh1强启动子驱动来源于特异腐质霉(Humicolo insolens)的内切葡聚糖酶HiNce5在不同碳源下表达，发现该菌株具有作为异源蛋白表达的良好宿主的潜力。
构建HiNce5基因定点表达载体，将其分别整合于△5677和△5677OExyr1菌株的cbh1位点，实现以cbh1启动子驱动HiNce5表达。结果表明，HiNce5在△5677和△5677OEx1yr1菌株中均获得成功表达和分泌。HiNce5在△5677OExyr1菌株的表达分泌水平显著高于在△5677中的水平，且葡萄糖和乳糖均可作为培养碳源，表明△5677OExyr1菌株可作为良好的异源蛋白表达底盘细胞。
三、构建了信号识别颗粒蛋白亚基SRP54和SRP72编码基因的启动子置换菌株，分析发现srp72敲低未明显影响菌株生长，而srp54敲低严重影响了木霉的生理生长及纤维素酶表达，但并未完全摧毁纤维素酶的合成分泌。
通过响应铜离子的启动子置换系统分别构建了信号识别颗粒蛋白亚基SRP54和SRP72编码基因的启动子置换菌株。研究发现，与野生型QM9414相比，srp72敲低未明显影响菌株生长，而srp54敲低导致里氏木霉的生长和生物量积累均受到显著影响，且细胞壁完整性严重受损。此外，srp54敲低后主要的纤维素酶表达量和胞外纤维素酶酶活均明显降低，但却并未完全摧毁纤维素酶的表达分泌，胞内外均检测到成熟形式的主要纤维素外切酶CBH1，这暗示可能存在非SRP依赖的途径协助纤维素酶编码mRNA易位至内质网。
目前对里氏木霉高效蛋白合成机理的研究主要集中在基因转录环节，而对分泌途径研究较少，限制了基于合成分泌机理的遗传改造以进一步提高内源/异源蛋白表达水平。内质网易位是分泌型蛋白高效合成的首要环节，低效的内质网易位会极大地降低蛋白的产量。虽然经典理论认为内质网锚定由信号识别颗粒蛋白SRP通过识别蛋白N端信号肽介导完成，但是有研究发现其它物种中内质网锚定存在着非SRP依赖方式。作为丝状真菌中的模式菌株，SRP在里氏木霉蛋白高效合成分泌中的作用值得探讨，这有助于揭示未知的内质网高效锚定方式，促进丝状真菌蛋白表达细胞工厂的构建和应用。
本论文主要包括两个方面的研究，一方面是基于(半)纤维素酶转录调控机理，采用菌株改造策略来优化重构里氏木霉胞外纤维素降解酶系;另一方面对SRP复合物重要亚基在里氏木霉中的功能进行探究。主要研究工作总结如下:
一、构建了一株主要纤维素酶基因缺失及转录激活调控因子XYR1过表达的△5677OExyr1菌株。该菌株在葡萄糖和乳糖碳源下的胞外酶系组成较野生型菌株QM9414发生显著变化，具有较高水平的葡萄糖苷酶和多种半纤维素酶酶活，能够有效促进木质纤维素底物中半纤维素的降解。
以纤维素内切酶CEL5A和CEL7B及外切酶CEL6A和CEL7A同时缺失的△5677菌株为出发菌株，使用tcu1强启动子对转录激活因子XYR1进行过表达，发现该菌株在葡萄糖和乳糖碳源下胞外酶谱发生明显变化，具有高水平的β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和甘露聚糖酶等酶活，胞外蛋白的质谱鉴定发现BGL1、XYN3和MAN5A等(半)纤维素酶以及CIP、Swollenin等降解辅助蛋白表达水平上调。在乳糖培养条件下，该菌株胞外酶系中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶的表达水平也明显提高，其酶活较野生型QM9414提高10倍，达到8U/mL。菌株△5677OExyr1在葡萄糖和乳糖条件下的胞外发酵液均可以显著促进复杂底物玉米皮中半纤维素类物质的释放。
二、在第一章构建的△5677OExyr1菌株中，以cbh1强启动子驱动来源于特异腐质霉(Humicolo insolens)的内切葡聚糖酶HiNce5在不同碳源下表达，发现该菌株具有作为异源蛋白表达的良好宿主的潜力。
构建HiNce5基因定点表达载体，将其分别整合于△5677和△5677OExyr1菌株的cbh1位点，实现以cbh1启动子驱动HiNce5表达。结果表明，HiNce5在△5677和△5677OEx1yr1菌株中均获得成功表达和分泌。HiNce5在△5677OExyr1菌株的表达分泌水平显著高于在△5677中的水平，且葡萄糖和乳糖均可作为培养碳源，表明△5677OExyr1菌株可作为良好的异源蛋白表达底盘细胞。
三、构建了信号识别颗粒蛋白亚基SRP54和SRP72编码基因的启动子置换菌株，分析发现srp72敲低未明显影响菌株生长，而srp54敲低严重影响了木霉的生理生长及纤维素酶表达，但并未完全摧毁纤维素酶的合成分泌。
通过响应铜离子的启动子置换系统分别构建了信号识别颗粒蛋白亚基SRP54和SRP72编码基因的启动子置换菌株。研究发现，与野生型QM9414相比，srp72敲低未明显影响菌株生长，而srp54敲低导致里氏木霉的生长和生物量积累均受到显著影响，且细胞壁完整性严重受损。此外，srp54敲低后主要的纤维素酶表达量和胞外纤维素酶酶活均明显降低，但却并未完全摧毁纤维素酶的表达分泌，胞内外均检测到成熟形式的主要纤维素外切酶CBH1，这暗示可能存在非SRP依赖的途径协助纤维素酶编码mRNA易位至内质网。