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随着全世界范围内老龄化问题的加剧，骨质疏松症正成为全世界各国越来越关注的重要问题。绝经后骨质疏松症的发病机制较为复杂，绝经后卵巢功能衰竭所致雌激素骤减是目前公认的绝经后骨质疏松症发生发展的重要原因。雌激素通过雌激素受体依赖途径调控间充质干细胞向成骨方向分化、抑制脂肪细胞形成、调控骨重建的平衡，但具体作用信号途径和机理至今尚未完全清楚。
雌激素受体途径是雌激素发挥作用的重要通路，雌激素与雌激素受体结合并转运入细胞核，激活启动子区域包含雌激素感应元件(estrogenre responseelements，EREs)的靶基因，相应基因表达并执行包括调控成骨分化在内的细胞生物学功能。周期素G2(Cyclin G2)基因的启动子区域包含1/2 EREs位点，能够与雌激素及雌激素受体复合物结合并抑制其mRNA转录和蛋白表达，提示Cyclin G2可能参与了雌激素调控的某些生物学功能。Cyclin G2是一种非经典的细胞周期素(cyclin)，具有抑制细胞周期及细胞增殖的作用。本课题组发现Cyclin G2能够抑制肿瘤细胞的克隆形成能力，并进一步研究证实Cyclin G2能够在肿瘤细胞中抑制经典Wnt信号通路活性(Wnt/β-catenin Signaling pathway)。
经典Wnt信号通路在生物的进化过程中极为保守，在细胞增殖、分化及胚胎的生长发育过程中发挥重要的调控作用。细胞外的Wnt信号分子结合到细胞膜上特异性受体Frizzled蛋白，使胞内的Dishevelled蛋白被激活，抑制糖原合成激酶-3β（glycogen syntheses kinase-3β，GSK-3β）磷酸化β-catenin的能力，导致β-catenin不能进入泛素化途径降解。β-catenin在细胞浆中持续累积增多到一定水平后，转移入细胞核内，与T细胞因子/淋巴增强因子(T-cell factor/lymphoidenhancer factor，TCF/LEF)家族结合并激活β-catenin靶基因的启动子，从而激活CCND1、C-MYC和RUNX2等经典Wnt信号通路的下游靶基因，进一步发挥相应的生物学效应。
近年来，有研究发现Cyclin G2能够通过与过氧化物酶体增殖剂激活受体γ(proliferator-activated receptorγ，PPAR-γ)结合，启动下游细胞成脂分化相关信号分子表达促进细胞的成脂分化，提示Cyclin G2可能参与细胞成骨的调控过程。另外，经典Wnt信号通路对成骨和成脂的双重调节与绝经后骨质疏松症的骨量减少而脂肪含量明显升高的现象相一致，表明该信号通路可能在绝经后骨质疏松症的发生发展中发挥重要的作用，但目前对雌激素与经典Wnt信号通路之间的联系、二者是否协同作用于细胞成骨分化的调控及绝经后骨质疏松症的发生发展尚有待进一步证实。
本研究拟在发现Cyclin G2抑制经典Wnt信号通路的基础上，进一步研究Cyclin G2调控经典Wnt信号通路的作用及分子机制;以具有成骨分化能力的C2C12细胞为研究对象，检测Cyclin G2对细胞成骨分化的调节作用并阐明其分子机制;深入分析和验证Cyclin G2对经典Wnt信号通路的调控在雌激素调节细胞成骨分化过程中扮演的角色，丰富细胞周期及细胞分化调控理论，为研究绝经后骨质疏松症的发生发展与防治提供理论基础。
实验材料和方法:
1、成骨条件培养液和雌激素诱导细胞成骨分化过程中，CyclinG2的表达分析
应用成骨条件培养液添加不同浓度的雌激素诱导C2C12细胞成骨分化，分别诱导48 h提取细胞总RNA和总蛋白，通过RT-PCR和Western blot方法检测周期素G2的内源表达水平改变;诱导7d裂解细胞，通过ALP活性测定试剂盒检测细胞ALP活性变化;诱导14 d经无水乙醇固定细胞，应用茜素红染色方法，检测细胞钙盐沉积能力变化。
2、成骨条件培养液、雌激素及Cyclin G2对细胞增殖的影响
分别应用成骨条件培养液添加不同浓度雌激素诱导C2C12细胞成骨分化或通过基因转染在细胞中过表达Cyclin G2，加药或转染的第0h、24 h、48 h和72h，采用CCK8方法检测C2C12细胞增殖情况，绘制生长曲线，分析成骨条件培养液、雌激素对细胞增殖的影响是否依赖于Cyclin G2的作用。
3、Cyclin G2过表达对细胞成骨分化能力影响的研究
在C2C12细胞中通过基因转染或逆转录病毒感染，使细胞过表达CyclinG2。通过成骨条件培养液诱导细胞成骨分化，转染后48 h提取细胞总RNA，检测细胞成骨分化标志(marker)基因表达水平改变;诱导7d裂解细胞，检测细胞ALP活性变化;诱导14 d经无水乙醇固定细胞，经茜素红染色检测细胞钙盐沉积能力差异。
4、经典Wnt信号通路在Cyclin G2调控细胞成骨分化过程中的作用分析
在C2C12细胞中过表达Cyclin G2，通过RT-PCR半定量方法和Western blot方法，检测C2C12细胞对β-catenin及其下游靶基因Runx2表达的影响，通过基因转染和逆转录病毒感染的方法在C2C12细胞中过表达Cyclin G2，应用LiCl激活细胞中经典Wnt信号通路活性，进一步选取特定时间点检测细胞成骨分化marker基因表达水平、ALP活性以及钙盐沉积能力，分析经典Wnt信号通路在Cyclin G2调节细胞成骨分化过程中的作用。
5、Cyclin G2负性调控经典Wnt信号通路参与雌激素调节细胞成骨分化的研究
通过基因转染或逆转录病毒感染在C2C12细胞中过表达Cyclin G2，添加雌激素诱导细胞成骨分化，感染48 h提取细胞总RNA和总蛋白，通过RT-PCR和Western blot方法检测成骨marker基因的内源表达水平改变;诱导7d裂解细胞，通过ALP活性测定试剂盒检测细胞ALP活性变化;诱导14 d经无水乙醇固定细胞，应用茜素红染色方法，检测细胞钙盐沉积能力变化。
6、Cyclin G2调节经典Wnt信号通路活性的作用靶点及分子机制研究
应用不同剂量的包装Cyclin G2基因（CCNG2）的逆转录病毒感染COS-7细胞，48 h后提取细胞总蛋白，Western blot检测Cyclin G2对GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin及其下游靶基因的影响;在COS-7细胞中过表达Cyclin G2，应用LiCl(40 mM)抑制GSK-3β活性，检测LiCl对Cyclin G2调节β-catenin及其下游靶基因能力的影响，分析Cyclin G2调控经典Wnt信号通路是否需要GSK-3β的活性;通过RNA干扰方法抑制COS-7细胞中内源Dpr1表达，Western blot方法检测Dpr1表达抑制对Cyclin G2负调控β-catenin及其下游靶基因的影响，明确Cyclin G2负性调控经典Wnt信号通路的作用靶点;在COS-7细胞中过表达Cyclin G2或干扰内源Cyclin G2表达水平，Western blot方法检测Cyclin G2对Dvl-2蛋白的影响;并通过抑制剂特异性抑制相应蛋白降解途径，Western blot方法检测Cyclin G2下调Dvl-2蛋白表达作用的改变，明确Cyclin G2负性调控经典Wnt信号通路的级联信号分子机制。
实验结果:
1、Cyclin G2在体外参与雌激素诱导细胞成骨分化的过程
通过RT-PCR半定量、Western blot及细胞成骨相关检测方法，检测成骨条件培养液与雌激素对细胞成骨分化及Cyclin G2表达的影响，发现二者在上调C2C12细胞成骨标志（marker）基因(Runx2，Oc，Col Ia和ALP)表达、细胞ALP活性(P＜0.001)和钙盐沉积能力的同时，能够引起Cyclin G2的表达mRNA和蛋白表达水平下调，且该下调作用与雌激素剂量和细胞成骨分化水平呈正相关。
2、雌激素对细胞成骨能力的调节不依赖于Cyclin G2对细胞增殖的影响
通过CCK8方法选取相同时间点检测成骨条件培养液、雌激素以及过表达Cyclin G2对C2C12细胞增殖的影响，发现成骨条件培养液和Cyclin G2能够显著抑制细胞增殖能力。添加雌激素对C2C12无明显调节作用，表明成骨条件培养液和雌激素对细胞成骨分化水平与Cyclin G2抑制细胞增殖的作用无关。
3、Cyclin G2负性调控细胞成骨分化能力
在C2C12细胞中通过基因转染或逆转录病毒感染，使细胞中Cyclin G2过表达。通过成骨条件培养液诱导细胞成骨分化，发现Cyclin G2过表达在C2C12细胞中能够下调细胞成骨分化marker基因表达水平、ALP活性(P＜0.05)以及钙盐沉积能力，表明Cyclin G2具有抑制细胞体外成骨分化能力的作用。
4、Cyclin G2通过经典Wnt信号通路负性调控细胞成骨分化能力
在C2C12细胞中过表达Cyclin G2，通过RT-PCR半定量方法和Western blot方法检测C2C12细胞对β-catenin及其下游靶基因Runx2表达的影响，发现Cyclin G2对β-catenin和Runx2的表达具有明显的下调作用，提示Cyclin G2可能通过经典Wnt信号通路调节细胞成骨分化能力。应用LiCl激活细胞中经典Wnt信号通路活性，进一步检测细胞成骨分化marker基因表达水平、ALP活性以及钙盐沉积能力，发现Cyclin G2过表达抑制细胞成骨分化的能力被LiCl抑制，表明Cyclin G2通过经典Wnt信号通路负性调控细胞成骨分化能力。
5、Cyclin G2抑制雌激素对细胞成骨分化的上调能力
应用雌激素诱导过表达Cyclin G2的C2C12细胞成骨分化，通过成骨相关检测方法检测细胞成骨分化水平，发现雌激素上调细胞成骨分化水平的能力被过表达Cyclin G2明显抑制，表明Cyclin G2是雌激素在体外调节细胞成骨分化能力的重要因子。
6、Cyclin G2调控经典Wnt信号通路的作用靶点和分子机制
应用不同剂量的包装Cyclin G2基因的逆转录病毒感染COS-7细胞，检测Cyclin G2对β-catenin及其下游靶基因的影响，发现Cyclin G2对抑制β-catenin及其下游靶基因的作用与Cyclin G2表达呈正相关;检测Cyclin G2对p-GSK-3β表达的影响;应用LiCl抑制GSK-3β活性，发现Cyclin G2抑制p-GSK-3β表达，而LiCl能够干扰Cyclin G2调节β-catenin及其下游靶基因的能力，表明该作用依赖GSK-3β的活性;通过RNA干扰方法抑制COS-7细胞中内源Dpr1表达，Western blot方法检测Cyclin G2对β-catenin及其下游靶基因的影响，发现Dpr1表达水平降低引起Cyclin G2负性调控β-catenin及其下游靶基因的作用受到抑制，表明Dpr1是Cyclin G2负性调控经典Wnt信号通路的作用靶点;在COS-7细胞中过表达Cyclin G2或干扰内源Cyclin G2表达水平，Western blot方法检测Cyclin G2对Dvl-2蛋白的影响，明确内源和外源Cyclin G2均具有抑制Dvl-2蛋白表达的作用;通过抑制剂特异性抑制相应蛋白降解途径，Western blot方法检测发现Cyclin G2下调Dvl-2蛋白表达的作用被MG-132抑制，表明Cyclin G2促进Dvl-2蛋白经泛素化途径降解。
结论:
1、Cyclin G2介导经典Wnt信号通路负性调控细胞的成骨分化能力。
2、Cyclin G2是雌激素调控细胞成骨分化能力的重要因子。
3、Cyclin G2通过结合Dpr1蛋白促进Dvl-2经泛素化途径降解，上调GSK-3β活性，从而对经典Wnt信号通路产生负调控作用。