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黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是目前对农业经济危害最为严重的植物病毒之一。CMV 2b蛋白在CMV的致病过程中扮演着致病因子,RNA沉默抑制子和病毒长距离移动决定因子等多个重要的角色。因此,阐明CMV 2b蛋白的致病机理对于发展控制CMV新方法和新策略具有重要的理论指导意义。FRad352b-CMV重组病毒是用Rad35-CMV株系的2b基因精确替换Fny-CMV株系的2b基因构建而成,该重组病毒在多种烟草寄主上均诱导轻花叶症状。其突变株FRad352bLeu-CMV病毒,和FRad352b-CMV仅有一个氨基酸之差,即第55位的Leu是由FRad352b-CMV的Pro突变而来。FRad352bLeu -CMV在本生烟上则引起严重卷曲叶、植株矮化、甚至植株坏死。Northern杂交分析FRad352b-CMV和FRad352bLeu-CMV在本生烟寄主中的子代RNA积累量,接种后第14天,结果显示: FRad352bLeu-CMV的子代RNA积累量显著高于FRad352b-CMV。由此可见,FRad352bLeu-CMV的强致病性与其子代RNA在寄主体内的高积累量有关。通过荧光定量PCR检测基因沉默通路中的相关蛋白因子—AGO蛋白家族和RDR蛋白,结果显示:具有高致病性的FRad352bLeu-CMV显著抑制寄主本生烟AGO家族中AGO1-1、AGO4-1的表达,而弱致病性的FRad352b-CMV侵染的本生烟中,这些沉默因子的表达量和Mock对照相比都有所升高。基于实验室前期的研究,利用构建好的含有FRad352b-CMV和FRad352b Leu-CMV的2b基因的农杆菌瞬时表达载体35S-2bPro和35S-2bLeu分析2b蛋白的瞬时表达对外源GFP转录后基因沉默的影响。通过电转化获得含有不同载体的农杆菌,并将表达不同2b蛋白的农杆菌与35S-GFP的农杆菌共浸润,在转GFP本生烟16c叶组织中分别瞬时表达GFP和不同的2b蛋白。共浸润第3天,35S-2bLeu和35S-Fny2b的浸润区出现亮绿斑,而35S-2bPro的浸润区变暗,GFP mRNA的Northern杂交分析确定GFP mRNA在35S-2bLeu和35S-Fny2b的浸润区大量积累;共浸润后第7天,尽管35S-Fny2b和35S-2bLeu仍表现亮荧光信号,但是,二者浸润区的GFPmRNA积累水平显著低于Mock对照,且与35S-2bPro相当,这些结果说明2bLeu虽然在初期对GFP的局部沉默具有明显的抑制作用,但随着时间的推移,2bLeu并不能抑制浸润区siRNA的产生,从而导致局部GFP mRNA的降解。在共浸润第14天,浸润35S-2bPro植株的顶端系统叶表现GFP系统沉默,而浸润35S-2bLeu的植株则依旧显绿光,说明其顶端的系统叶GFP没有被诱导沉默。Northern杂交结果也显示:在浸润35S-2bPro的植株顶端系统叶中检测到少量的GFP mRNA积累,显著低于在35S-2bLeu或35S-Fny2b浸润的植株顶端系统叶中的积累。通过荧光定量PCR检测第3天浸润区基因沉默通路中的AGO4-1和RDR6,结果显示:与Mock相比,出现亮绿斑的35S-2bLeu的浸润区中AGO4-1和RDR6的积累受到抑制,而GFP发生降解的35S-2bPro的浸润区中AGO4-1和RDR6的表达量反而有一定程度的升高。因此,我们推测第55位的Leu对2b蛋白的高级结构有一定的影响,从而对AGO4-1和RDR6起到抑制作用,从而达到抑制系统沉默和DNA甲基化的目的。综上所述,我们推测2bLeu介导的高致病性是通过其阻止siRNA的系统移动,并抑制AGO4-1和RDR6等沉默因子的表达,来实现病毒高效的系统移动和复制,从而导致寄主表现出严重的病毒症状。