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目的:
探讨吡格列酮对严重烫伤小鼠创面组织愈合过程中TNF-α和NF-κB的表达影响。
方法:
1.建立30%全身体表面积(TBSA)Ⅲ°烫伤小鼠模型
选择健康SPF级ICR小鼠130只(天津医科大学实验动物中心提供),雌雄各半,体质量29~32g,鼠龄6~8周。小鼠背部按30%TBSA用4%Na2S试剂退毛,腹腔注射4%水合氯醛(40mg·kg-1)麻醉,麻醉成功后将小鼠背部置于100℃热水中烫12s,制成烫伤面积为30%的Ⅲ°烫伤模型(病理切片证实,正常组不烫伤),烫伤后立即腹腔注射乳酸钠林格液(40mg·kg-1)复苏。
2.实验动物的分组
随机分成4组,正常组10只,对照组(Ⅰ)、实验Ⅱ组、实验Ⅲ组各40只。建模成功后于每日晨8时Ⅰ组予以0.5mL·d-1生理盐水灌胃,Ⅱ、Ⅲ组分别予以10mg·kg-1·d-1、40mg·kg-1·d-1吡格列酮灌胃(根据预实验和参考文献确定2个剂量)。吡格列酮每日晨8时灌胃一次,连续2周。
3.观察指标
(1)空腹血糖(FBG)
实验动物禁食过夜,于晨8时断头迅速取血。正常组10只一次性处死,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组分别于1、3、7、14d各处死10只。各组处死小鼠时用一次性血糖试纸和血糖仪即时测量FBG。
(2)空腹胰岛素(FIns)
各组分别于1、3、7、14d各处死10只小鼠时(正常组10只一次性处死),收集血液标本2mL于3000r/min、30min、4℃离心。收集血清0.5mL于-80℃保存,用于空腹胰岛素测定。实验结束时,将制备好的0.5mL血清置于样品杯中,放置于全自动化学发光免疫分析仪上(运用化学发光免疫法测量FIns的含量),调整好检测参数后开始检测,读取光量子数,根据标准曲线计算出FIns含量。
(3)计算IR值
利用稳态模式法(HOMA)计算IR值:胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FBG(mmol/L)×FIns(mIU/L)/22.5。
(4)创面组织中TNF-α和NF-κB的表达
将创面组织标本常规石蜡包埋,厚度5μm连续切片。常规脱蜡至水后,免疫组织化学染色(SABC法)检测TNF-α和NF-κB的表达。免疫组织化学染色(DAB显色)结果:阳性呈棕黄色颗粒(主要在细胞浆和/或细胞核中表达)。显微镜下观察并截图:运用计算机图像处理软件进行分析,分别随机计数每张切片5个无重复高倍视野(×400),测定平均灰度值,以灰度值表示TNF-α和NF-κB的表达情况。
4.统计方法
采用SPSS18.0进行数据的统计和处理。数据均以(x)+s表示,资料采用单因素方差分析(ANOVA),若有统计学差异采用LSD-t检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
结果:
1.各组小鼠空腹血糖(FBG)的测定
各组处死小鼠时用一次性血糖试纸和血糖仪即时测量FBG,检测结果显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组FBG与正常组比较具有明显差异(P<0.05)。
2.各组小鼠空腹血清胰岛素(FIns)的测定
运用化学发光免疫法测量FIns的含量,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组FIns与正常组比较具有明显差异(P<0.05)。
3.各组小鼠胰岛素抵抗(IR)
同一时相点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组HOMA-IR值两两比较均存在显著性差异(P<0.01);同一组内不同时相点HOMA-IR值两两比较,均存在差异(P<0.05或P<0.01);且分别与正常组HOMA-IR值比较,亦均存在差异(P(0.05)。
4.各组小鼠创面组织中TNF-α的表达
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组同一时相点和同一组内不同时相点,TNF-α灰度值两两之间分别进行比较,均有显著性差异(P<0.01)。
5.各组小鼠创面组织中NF-κB的表达
Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组同一时相点和同一组内不同时相点,NF-κB灰度值两两之间分别进行比较,均有显著性差异(P<0.01)。
结论:
1.伤后Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的小鼠空腹血糖(FBG)、空腹血清胰岛素(FIns)较正常组明显升高,证明30%全身体表面积(TBSA)Ⅲ°烫伤小鼠模型建模成功(病理切片证实),产生明显胰岛素抵抗(IR)。
2.Ⅰ组与Ⅱ、Ⅲ组空腹血糖(FBG)、空腹血清胰岛素值(FIns)比较,具有显著性差异(P<0.05),证明吡格列酮能有效控制胰岛素抵抗(IR)。
3.Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间不同时相点TNF-α灰度值两两比较和同一组内不同时相点两两比较,均有显著性差异(P<0.01)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组之间不同时相点NF-κB灰度值两两比较和同一组内不同时相点两两比较,均有显著性差异(P<0.01)。吡格列酮能有效抑制烧(烫)伤后胰岛素抵抗(IR),进而抑制创面组织中TNF-α和NF-κB的表达,改善和促进创面的愈合。