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目的：对我国东北地区原发性开角型青光眼家系患者(primary open angle glaucoma，POAG)进行分子遗传学分析，探讨0PTN基因与原发性开角型青光眼之间的关系。建立人突变体OPTN(E50K)细胞模型及转基因小鼠模型并进行鉴定。
方法：对家族性原发性开角型青光眼两个家系进行临床研究和系谱分析。采集家系L的6例患者和6例健康成员及家系C的4例患者和4例健康成员的静脉血，提取基因组DNA。通过连锁分析确定致病基因的染色体位点后，应用聚合酶链反应(PCR)扩增0PTN基因外显子，直接测序确定致病的基因突变。利用分子生物学方法在RGC-5细胞瞬时表达OPTN及其突变体OPTN(E50K)，通过RT-PCR和Western blotting检测OPTN蛋白的表达，共聚焦显微镜对OPTN蛋白进行亚细胞定位，利用FITC Annexin V-PI检测细胞凋亡，Fluo-3AM标记钙离子共聚焦显微镜检测细胞游离钙离子。利用分子克隆的方法构建含有小鼠视网膜神经节特异性启动子c-KIT、mOPTN基因和hGHpolyA的转基因载体c-KIT-OPTN(E50K)，以显微注射的方法将5530bp的转基因片段导入小鼠基因组，通过PCR和DNA dot blot检测目的基因的整合，利用RT-PCR和Western blotting检测OPTN(E50K)蛋白的表达，采用免疫组织化学方法检测小鼠视网膜神经节细胞中OPTN(ESOK)蛋白表达
结果：家族性原发性开角型青光眼家系L患者的0PTN基因第10外显子发生了错义突变，1274位AAA变为GAA，对应的赖氨酸替换为谷氨酸(Lys322G1u)。家系L中健康成员、家系C全部成员和87名正常人均未发现该突变。利用脂质体瞬时转染真核表达载体PcDNA3.0-his-OPTN和PcDNA3.0-his-OPTN(E50K)到RGC-5细胞，48小时后OPTN蛋白在细胞中大量表达，共聚焦显微镜下显示OPTN蛋白主要分布在细胞质中，并且围绕在核膜周围，相比对照组，OPTN(E50K)可以诱导细胞凋亡，并且发现细胞内游离钙明显增多。共注射350枚受精卵，移植到14只假孕母鼠的输卵管中发育，子代小鼠出生总数72只，经PCR鉴定共有12只小鼠在基因组上整合有OPTN(E50K)基因，阳性率为16.67％。RT-PCR和Western blotting表明OPTN(E50K)蛋白仅在视网膜中表达，免疫组织化学方法检测到OPTN(E50K)蛋白在转基因小鼠视网膜神经节细胞中过量表达。
结论：0PTN基因新突变Lys322Glu是家系L家族性原发性开角型青光眼的致病基因。Lys322Glu在中国人常染色体显性遗传性原发性开角型青光眼的发病机制中可能起重要作用。人突变体OPTN(E50K)蛋白可以诱导RGC-5细胞凋亡，同时细胞内游离钙离子明显升高，推测由于OPTN(E50K)蛋白诱发细胞内钙超载引发细胞凋亡。成功构建视网膜神经节细胞特异表达OPTN(E50K)转基因小鼠模型，为研究突变型OPTN(ESOK)蛋白的致病机制和原发性开角型青光眼的防治提供工具。