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青蒿素是从药用植物黄花蒿ArtemisiaannuaL.(又名青蒿)中提取的一种含有过氧桥基团结构的新型倍半萜内酯,是治疗脑型疟疾和抗氯喹恶性疟疾的特效药物。然而,天然青蒿中青蒿素含量很低(0.01%~0.8%,DW),使得青蒿素供应不足,价格昂贵。化学合成青蒿素,成本高、毒性大不能应用于生产。因而培育高产青蒿素的青蒿是一个共同追求的目标。
植物体内存在多条代谢途径,相互之间存在着作用与影响。茉莉酸甲酯(methyljasmonate,MeJA)作为植物生长调节剂,广泛存在于植物中,在植物应激反应和次生代谢调控中起着至关重要的作用。外源MeJA能够诱导不同植物中多种次生代谢产物超量积累。研究表明,用外源MeJA处理包括烟草(Nicotianatabacum)、红豆杉(Taxusmairei)、莨菪(Scopoliaparviflora)和青蒿等植物均能够极大提高其次生代谢产物合成能力。但是该方法基本停留在处理植物细胞或发根的层面,不适用于喷施大规模田间种植的药用植物。基于此,本研究通过在分子水平上改造MeJA生物合成途径,改变MeJA在植物细胞内水平,将外源MeJA诱导青蒿素积累这一现象固化为转基因青蒿的遗传属性,以达到提高青蒿素含量之目的。
茉莉酸羧甲基转移酶(jasmonicacidcarboxylmethyltransferase,JMT)是MeJA生物合成途径中最后一个酶,也是MeJA合成的限速酶,催化茉莉酸(jasmonate,JA)合成MeJA。研究表明,在拟南芥(Arabidopsisthaliana)中过量表达JMT基因可以使MeJA的含量提高,同时可增强对真菌Botrytiscinerea侵染的耐受性,这与拟南芥中其它次生代谢产物合成能力提高有关。
本研究采用转基因技术,以根癌农杆菌LBA4404(p1304+-AtJMT)介导,采用叶盘法将AtJMT导入青蒿中;并以10mg·L-1的潮霉素(hygromycin,Hygr)进行抗性筛选,获得了抗性芽;35d后待抗性芽长至2cm左右将其转至MS+0.05mg·L-1萘乙酸(1-naphthylaceticacid,NAA)+400mg·L-1头孢霉素(cefalexin,cef)+10mg·L-1Hygr培养基上继续筛选培养并生根,抗性芽生长及生根状况良好。待除菌完全后对青蒿进行基因组PCR检测,在转基因青蒿中能够检测到AtJMT和Hygr基因,而非转基因青蒿不能检测到AtJMT和Hygr基因,并以农杆菌virD1基因作为对照以排除农杆菌污染。46株抗性苗中获得6个独立转化AtJMT的青蒿株系。将已经通过基因组PCR检测的阳性植株在MS+1mg·L-16-苄基腺嘌呤(6-benzylaminopurine,6-BA)+0.1mg·L-1NAA培养基上进行扩繁;待芽长至2cm左右在不含任何激素的MS培养基上进行生根培养;待苗长至5cm左右时,将其转到品氏托普基质中炼苗,最后移栽到试验田中。收集在田间生长4个月的转基因及非转基因植株叶片,作为后续分子检测及含量检测的植物材料。
采用qPCR检测目的基因AtJMT在青蒿中的表达情况。结果显示,在青蒿中超表达AtJMT后,不同转基因青蒿株系中AtJMT的表达情况差异较大。AtJMT表达量的高低依次为:J61>J27>J45>J5>J24>J25,其中J61和J27中AtJMT表达量较其它株系高得多。
同时,GC-MS结果显示,在转AtJMT基因青蒿中MeJA含量较非转基因也有明显提高,其中J61株系含量最高,是非转基因的13倍,MeJA含量由2.673μg·g-1FW提高到35.305μg·g-1FW,MeJA含量的增加趋势与AtJMT基因的表达量结果基本吻合。说明转基因株系中超表达AtJMT基因确实可以促进MeJA的合成。
采用HPLC-ELSD检测转基因和非转基因青蒿中青蒿素含量,结果显示,在所有转基因株系中,青蒿素含量均有提高,J24株系青蒿素含量提高最多,约为野生青蒿的5.8倍,含量从0.901mg·g-1DW提高到5.212mg·g-1DW。
此外,采用qPCR检测了转基因和非转基因青蒿中青蒿素生物合成途径上11个相关基因(包括HMGR、DXS、DXR、HDS、HDR、FPS、ADS、CYP、DBR2、ALDH1、RED1)表达量。结果表明,与非转基因青蒿相比,转基因株系中青蒿素生物合成途径上的10个基因(HMGR、DXS、DXR、HDS、HDR、FPS、ADS、CYP、DBR2、ALDH1)的表达水平有明显上调;而与青蒿素生物合成途径的一个竞争支路上的1个基因—RED1有下调的趋势。这说明,转AtJMT使得内源MeJA含量提高,导致青蒿素合成途径中相关基因表达量上升,控制代谢流更多的向青蒿素合成方向转移,从而促进青蒿素的积累。
本研究通过转基因技术在青蒿中超表达AtJMT基因,使得青蒿内源MeJA生物合成能力增强,内源MeJA含量提高;MeJA导致青蒿素生物合成途径中多个基因表达上调,从而使得代谢流更多的向青蒿素生物合成方向流动,最终表现为青蒿素生物合成能力和含量的提高。转JMT基因青蒿中MeJA和青蒿素含量的提高是稳定且持久的,体现出比外源MeJA诱导更可靠、更稳定、可遗传的优越性。获得的高产青蒿素转基因材料可以作为青蒿素新药源,经过快繁、扩大培养能实现青蒿素的商业化生产,满足市场对青蒿素的大量需求。