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目的:
1.预测表皮生长因子受体2(HER2/neu)的CTL和B细胞联合表位,为其单克隆抗体的制备,表位疫苗设计和相关免疫效应等研究提供理论依据。
2.综和多参数表位预测分析,筛选出3个CTL和B细胞联合表位多肽,分别构建含预测CTL和B细胞联合表位多肽的原核重组质粒,采用6个组氨酸标签(His.tag)表达联合表位蛋白,并用SDS-PAGE、Western Blot进行分析鉴定。
方法:
1.以HER2/neu的完整氨基酸序列为研究基础,用SOPMA、HNN、GOR三种方案分析比较HER2/neu二级结构,并用亲水性、极性、柔韧性、表面可及性和抗原性等多参数分析其B细胞优势表位,采用吴氏平均抗原指数对上述结果进行综合分析,预测HER2/neu的优势B细胞表位。采用SYFPEITHI超基序法结合多项式法,预测HER2/neu的HLA-A2及HLA-A24限制性CTL表位。筛选HER2/neu全长序列中吴氏抗原性指数较高且相临近B细胞和CTL,表位的肽段作为联合表位蛋白。
2.选取预测的CTL和B细胞联合表位多肽序列,按原核系统偏爱的氨基酸密码子优化,合成寡核苷酸引物,退火获得目的基因后克隆至原核表达载体pET32a(+)多克隆位点内。将重组载体转化E.coli BL21表达联合蛋白,并经SDS-PAGE、Western Blot分析鉴定。
结果:
1.SOPMA、GOR和HNN三种方法对HER2/neu二级结构的预测均表明,二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角。B细胞表位可能位于其N端30～38,117～124,186～195,245～250,378～388,497～504,601～606,939～943,992～997,1106～1116,1121～1126,1140～1158,1166～1175,1225～1234,1240～1246区段。CTL表位可能位于106～114,141～149,153～161,369～377,398～406,411～419,442～450,457～465,460～468,466～474,653～661,654～662,665～673,666～674,799～807,828～836,1093～1101区段。CTL和B细胞联合表位位于106～125,369～388,456～474,633～662,962～979,1091～1117区段。
2.经酶切、PCR鉴定和核苷酸测序表明,成功构建了3个编码B细胞和CTL联合细胞表位的原核表达质粒,分别命名为:pET32a/HER2-106～125、pET32a/HER2-369～388和pET32a/HER2-962～979。经SDS-PAGE分析表明,在37℃1.0mM IPTG作用下诱导5h均能很好地表达目的蛋白,相对分子质量(Mr)约为20kDa,与预期Mr大小吻合；蛋白表达量均约占细菌总蛋白量的20％左右。经WesternBlot结果显示单一明显条带,与SDS-PAGE中位置吻合。用Ni-NTA树脂亲和层析法分别纯化得到表位联合蛋白,分别命名为:HER2-106～125、HER2-369～388和HER2-962～979和pET32a(+)空载体所表达的His蛋白,纯度均达95％以上。
结论:
1.预测并筛选了3个可能的HER2/neu B细胞和CTL联合细胞表位。
2.通过分子克隆分别成功构建了含CTL和B细胞联合表位的重组质粒pET32a/HER2-106～125,pET32a/HER2-369～388和pET32a/HER2-962～979在原核表达系统内分别高效表达了表位联合蛋白HER2-106～125、HER2-369～388和HER2-962～979通过亲和层析法得到了纯化的表位联合蛋白。为HER2/neu表位疫苗设计和相关免疫效应奠定了基础。