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目的
探讨中药有效成分神经再生素(NRF)对实验性青光眼兔玻璃体谷氨酸(Glu)浓度以及视网膜兴奋性谷氨酸转运体1(EAAT1)、转运体2(EAAT2)、谷氨酰胺合成酶(GS)、组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-1)表达的影响；探讨NRF抑制青光眼视神经损害可能的作用机制，为NRF的青光眼视神经保护作用提供理论依据。
方法
实验兔随机分为正常对照组、BSS组、NRF1组、NRF2组、NRF3组和BDNF组；正常对照组5只，各模型组每组10只。前房灌注平衡盐溶液(BSS)建立大耳白兔双眼实验性急性青光眼模型。各模型组在前房灌注前2天及灌注后第1、4天玻璃体腔内分别注射50μlBSS(BSS组)、50μlNRF(0.031μg/μlNRF1组，0.062μg/μlNRF2组，0.155μg/μlNRF3组)、50μlBDNF(0.033μg/μlBDNF组)各一次。各模型组随机取5只兔在双眼前房灌注前2天及灌注后第7天抽取玻璃体0.1ml，用高效液相色谱分析检测玻璃体Glu浓度；灌注后第7天处死实验兔，右眼用免疫组织化学检测视网膜EAAT1、EAAT2、GS、t-PA和PAI-1的蛋白表达与定位，左眼用Westernblot分析检测视网膜EAAT1、EAAT2、GS、t-PA和PAI-1的蛋白表达。
结果
1.眼压：
灌注前眼压，BSS组为16.29±1.81mmHg、NRF1组为17.75±1.97mmHg、NRF2组为17.00±1.78mmHg、NRF3组为18.14±2.01mmHg、BDNF组为16.98±1.42mmHg；灌注时眼压，BSS组为56.62±3.88mmHg、NRF1组为55.57±2.26mmHg、NRF2组为58.61±3.86mmHg、NRF3组为57.28±3.81mmHg、BDNF组为54.85±1.85mmHg；各组间灌注前眼压、灌注时眼压均无差别(P＞0.05)。结果表明兔高眼压模型制作稳定。
2.玻璃体Glu浓度：
灌注前玻璃体Glu浓度，BSS组为3.22±1.23μmol/L、NRF1组为2.43±0.87μmol/L、NRF2组为2.39±1.45μmol/L、NRF3组为2.54±1.47μmol/L、BDNF组为3.17±1.61μmol/L；灌注前各组之间的玻璃体Glu浓度无差别(P＞0.05)；灌注后第7天玻璃体Glu浓度，BSS组为29.46±6.02μmol/L、NRF1组为18.57±2.18μmol/L、NRF2组为15.95±2.63μmol/L、NRF3组为9.32±3.58μmol/L、BDNF组为6.10±2.53μmol/L；BSS组、NRF1组、NRF2组和NRF3组的玻璃体Glu浓度明显高于灌注前(P＜0.05)；BSS组的玻璃体Glu浓度高于其他各组(P＜0.05)；NRF1组与NRF3组相比玻璃体Glu浓度升高，差异有显著性(P＜0.05)；NRF3组与BDNF组相比，玻璃体Glu浓度差异无显著性(P＞0.05)。结果表明高眼压后兔眼玻璃体Glu浓度升高，NRF和BDNF均有抑制作用。
3.EAAT1、EAAT2、GS、t-PA和PAI-1的Westernblot分析：
灌注后第7天EAAT1与内参β-actin灰度比值，正常对照组为70.92±2.63％、BSS组为70.94±2.43％、NRF1组为75.34±2.30％、NRF2组为79.35±2.41％、NRF3组为83.81±3.01％、BDNF组为86.19±3.70％；BSS组和NRF1组与正常对照组相比，EAAT1的表达无明显变化(P＞0.05)；NRF2组、NRF3组和BDNF组与正常对照组以及BSS组相比，EAAT1的表达明显升高(P＜0.05)；NRF3组与BDNF组相比，EAAT1表达的差异无显著性(P＞0.05)。灌注后第7天EAAT2与β-actin灰度比值，正常对照组为75.42±3.67％、BSS组为18.25±1.31％、NRF1组为28.37±4.22％、NRF2组为36.77±4.51％、NRF3组为54.40±3.50％、BDNF组为64.27±3.48％；各模型组与正常对照组相比，EAAT2的表达明显降低，差异有显著性(P＜0.05)；BSS组下降最明显，与其他各组相比，差异有显著性(P＜0.05)；NRF1组、NRF2组与NRF3组相比EAAT2表达降低，差异有显著性(P＜0.05)；NRF各组与BDNF组相比，EAAT2表达降低差异有显著性(P＜0.05)。灌注后第7天GS与β-actin灰度比值，正常对照组为29.54±4.39％、BSS组为92.29±3.45％、NRF1组为77.55±4.17％、NRF2组为75.16±3.77％、NRF3组为61.99±2.77％、BDNF组为70.29±4.13％；BSS组与其他各组相比，GS的表达明显升高，差异有显著性(P＜0.05)；NRF1组、NRF2组与NRF3组相比，GS的表达升高差异有显著性(P＜0.05)；NRF3组与BDNF组相比，GS表达的差异无显著性(P＞0.05)。灌注后第7天t-PA与β-actin灰度比值，正常对照组为57.95±3.79％、BSS组为89.36±3.59％、NRF1组为79.25±3.80％、NRF2组为79.93±3.54％、NRF3组为78.29±3.38％、BDNF组为66.66±2.16％；BSS组、NRF1组、NRF2组以及NRF3组与正常对照组相比，t-PA表达明显升高(P＜0.05)；BSS组与NRF1组、NRF2组、NRF3组和BDNF组相比，t-PA表达明显升高(P＜0.05)；NRF1组、NRF2组和NRF3组三组之间t-PA表达无明显差异(P＞0.05)；NRF各组与BDNF组相比，t-PA表达明显升高(P＜0.05)。灌注后第7天PAI-1与β-actin灰度比值，正常对照组为58.30±4.62％、BSS组为109.72±5.24％、NRF1组为88.87±3.02％、NRF2组为92.62±3.56％、NRF3组为76.00±3.87％、BDNF组为69.24±3.08％；各模型组与正常对照组相比，PAI-1表达明显升高(P＜0.05)；BSS组与NRF1组、NRF2组、NRF3以及BDNF组相比，PAI-1表达显著升高(P＜0.05)；NRF1组和NRF2组与NRF3组相比，PAI-1表达升高，差异有显著性(P＜0.05)；NRF3组与BDNF组相比，PAI-1表达无明显差异(P＞0.05)。灌注后第7天各组t-PA、PAI-1灰度值比(t/P)，正常对照组为99.51±2.62％、BSS组为82.27±7.14％、NRF1组为89.13±1.55％、NRF2组为86.30±3.03％、NRF3组为103.00±3.77％、BDNF组为96.31±1.71％；BSS组与NRF3组、BDNF组以及正常对照组相比，t/P值减小，差异有显著性(P＜0.05)；NRF3组、BDNF组和正常对照组三组之间，t/P值无明显差异(P＞0.05)。结果表明NRF和BDNF均能上调EAAT1的表达；抑制EAAT2表达的下降；抑制t-PA表达升高；维持t/P值平衡。
4.EAAT1、EAAT2、GS、t-PA和PAI-1的免疫组织化学检测：
EAAT1存在于Müller细胞上，EAAT1的免疫组化染色从内界膜至外界膜、Müller纤维以及内、外丛状层都有阳性标记；NRF3组和BDNF组与BSS组和正常对照组相比EAAT1的免疫组化染色明显增强。EAAT2免疫组化染色分布于视锥及双极细胞，标记最强烈之处在内丛状层，证明EAAT2在靠近双极细胞与RGCs之间突触处最丰富；高眼压后，BSS组EAAT2免疫组化染色明显减弱，NRF各组和BDNF组染色介于正常对照组和BSS组之间。GS免疫组化染色主要见于Müller细胞胞体，呈不规则染色，高眼压后BSS组见Müller细胞胞体浓染，内丛状层弥散染色增强，NRF各组和BDNF组染色介于它们之间。正常对照组t-PA的染色主要分布在双极细胞，RGCs层和内丛状层也有少量分布；高眼压后BSS组染色明显加重，神经纤维层和神经节细胞层增强尤为显著，NRF各组和BDNF组t-PA的染色介于它们之间。正常对照组PAI-1的染色主要分布在双极细胞内，内丛状层有轻度染色；高眼压后BSS组染色明显加重，神经纤维层、神经节细胞层、内丛状层和Müller细胞都见强烈染色，神经纤维层和神经节细胞层增强尤为显著，NRF各组和BDNF组PAI-1的染色介于它们之间。结果表明：EAAT1、EAAT2、GS、t-PA和PAI-1在实验兔视网膜中均有明确定位，免疫组化蛋白表达趋势同Westernblot分析。
结论
急性青光眼模型兔眼玻璃体Glu浓度明显升高；实验兔视网膜中均不同程度地表达EAAT1、EAAT2、GS、t-PA和PAI-1；NRF和BDNF均可通过上调EAAT1表达和抑制EAAT2表达的下降降低玻璃体Glu浓度，从而减少Glu对RGCs的兴奋性毒性作用；NRF和BDNF均可通过抑制t-PA表达升高、维持t/P值平衡从而减少t-PA对RGCs的神经毒性作用；NRF具有视神经保护作用，但有剂量依赖性。