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刺参是一种具有特殊质构的棘皮动物,作为传统的海珍品,在中国、日本、韩国等亚洲国家深受消费者喜爱。我国的刺参产量逐年递增,但是刺参在加工、运输过程中极易出现自溶现象,产生这一现象的主要原因是结构蛋白被降解。胶原蛋白是刺参最主要的营养成分,占总蛋白含量的70%左右,也是最主要的结构蛋白,赋予刺参体壁一定的韧性和强度。胶原蛋白的降解被认为是刺参自溶的主要原因,严重影响刺参体壁的稳定性。本文研究刺参胶原蛋白以及内源性蛋白酶对胶原蛋白的降解作用,为阐明刺参胶原蛋白的代谢和刺参自溶机理提供重要信息。首先,从刺参（Stichopus japonicas）体壁中纯化获得一种胃蛋白酶促溶型胶原蛋白（pepsin-soluble collagen,SjPSC）。SjPSC是由三条相同的α链构成的同源三聚体,α链的分子量约为130 kDa。傅立叶红外光谱、圆二色谱分析表明,制备的SjPSC具有完整的三股螺旋结构;差示扫描量热仪检测结果显示SjPSC的热变性温度为34.0±0.12°C。利用高纯度的SjPSC制备抗刺参胶原多克隆抗体,通过Western blot检测发现该抗体只与刺参（Stichopus japonicus）和东海乌参（Acaudina leucoprocta）两种海参的胶原蛋白发生反应,说明该抗体特异性良好。克隆获得SjPSCα的基因序列（SjCOLα）,该基因开放阅读框（opne reading frame,ORF）共4203个碱基,编码1400个氨基酸残基,推导的氨基酸序列包含信号肽、N-端前肽、N端、C-端前肽、C端和三股螺旋区,与多个物种的胶原蛋白α链氨基酸序列相似性均低于50%;三股螺旋区Gly-Gly-Y的数量（9个）多于鲍鱼、罗非鱼和猪的α链,而Gly-Pro-Pro的数量（21个）却少于这些生物胶原蛋白的α链,这种序列特征与SjPSC的热稳定性较弱有关。刺参胶原蛋白理化性质和氨基酸序列的分析结果为研究刺参自溶过程胶原蛋白的变化以及自溶相关蛋白酶作用机理提供了良好的理论基础。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）是刺参自溶过程中参与降解胶原蛋白的关键酶类。尽管该酶活力很高,但在刺参体内含量极少,难以纯化获得天然蛋白酶。为研究MMP参与刺参自溶的机理,制备有活性的重组蛋白酶是更有效的方法。本研究克隆获得刺参MMP-2完整的编码区序列,共1977个碱基,编码658个氨基酸残基,推导的氨基酸序列含有信号肽、前肽、包含三个II型纤维连接蛋白结合域的催化区和C端类血红素结合区。在大肠杆菌表达系统中成功表达和纯化了MMP-2的催化区（rMMP-2）,其分子量约为40 kDa。rMMP-2分解明胶的活性需要Ca2+的参与,反应的最适温度为40°C,最适pH为8.5,说明它是一种弱碱性蛋白酶。圆二色谱分析结果显示,其变性温度为56.80±0.25°C。rMMP-2能有效分解刺参胶原,且产物具有清除DPPH自由基和羟基自由基的活性,EC50值分别为3.59 mg/mL和2.77 mg/mL。这些实验结果表明MMP-2在刺参自溶过程中具有降解胶原蛋白的作用。此外,从刺参肠道中纯化获得一种分子量约为34 kDa的蛋白酶,该酶具有分解胶原活性,通过肽质量指纹图谱鉴定其属于丝氨酸蛋白酶（serine proteinases,SP）。但天然SP难于分离纯化,不利于深入研究SP与胶原的关系。因此,运用基因工程表达获得具有活性的重组SP（rSP）显得尤为重要。本研究进一步克隆获得刺参SP完整的编码区序列,共1134个碱基,编码377个氨基酸残基。在大肠杆菌表达系统中成功融合表达并纯化了具有活性的rSP。运用荧光底物分析,表明rSP的最适温度为35°C,最适pH为7.5,与天然SP的性质相似。rSP能有效地降解胶原蛋白,高效液相色谱分析发现降解产物中,分子量小于5 kDa的小肽占88.6%。利用肽质量指纹图谱分析酶切位点,结果表明rSP更易切割蛋白质序列中P1位为Arg的肽键;同时当P1位为Lys或Gly时也具有切割作用,但效率较低。这些结果证明SP也是刺参自溶过程降解胶原蛋白的关键酶。一直以来,刺参是国内外研究者热点关注的水产动物之一。本研究以刺参为研究对象,首次报道刺参胶原的基因,对刺参胶原蛋白进行了分析;对刺参MMP-2和SP基因全序列、重组表达、生理生化性质及其与胶原蛋白的关系进行了深入的研究。首次将高纯度、高活性的rMMP-2用于水解刺参胶原蛋白制备生物活性肽。分析了海参SP对SjPSC的酶切位点。本研究结果为深入了解刺参胶原蛋白在新陈代谢过程中的作用,探索刺参胶原的生物活性奠定了基础,并揭示了刺参自溶所涉及的相关蛋白酶及其作用机理。