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[研究背景及目的]
淋巴管内皮细胞(Humanlymphaticendothelialcells，HLECs)作为淋巴管系统主要的功能细胞之一，是位于管腔内表面的一种单层扁平上皮。它在诸多生理病理过程中扮演重要角色，参与维持体液平衡，调节淋巴细胞再循环、机体免疫反应和组织液及蛋白质的运输，在疾病（如癌细胞的淋巴结转移或炎症的扩散）过程中也起着重要作用。淋巴管生成的基本过程包括增殖、迁移和管样结构形成。新淋巴管的生成，包括一系列复杂的细胞活动，并且这些活动受促淋巴管、抑淋巴管生成信号通路的调节。因此研究HLECs应考虑新生淋巴管及调节淋巴管生成的信号通路。P13K/Akt信号转导通路是与细胞分化、增殖关系最密切的信号转导通路之一。其对肿瘤细胞蛋白合成，细胞周期相关蛋白的调控，肿瘤淋巴管生成有重要调节作用。该通路的活化可以抑制多种刺激诱发的细胞凋亡，促进细胞周期的进展，从而促进细胞的生存和增殖，同时参与淋巴管形成，在肿瘤的的形成、侵袭和转移中，有着重要的作用。金龙蛇颗粒是根据魏品康教授抗肿瘤临床经验方“消痰散结方”研制而成，目前处于中药新药临床前研究阶段。前期对消痰散结方抗淋巴转移的研究中，发现消痰散结方有抗淋巴结转移的作用，能减低胃原位移植瘤局部浸润和淋巴转移;在胃癌转移抑制实验中，消方组降低胃周淋巴结转移率;降低人胃腺癌MKN-45原位移植瘤组织中微淋巴管的密度和VEGF-C及VEGFR-3的表达。但消痰散结方抑制胃癌淋巴转移的具体机制尚不明确。因此本课题通过体外培养人淋巴管内皮细胞，运用基质胶成管实验、凋亡、迁移实验及Western-blot等方法，观察金龙蛇颗粒对淋巴管内皮细胞体外成管能力、凋亡、迁移能力以及对PI3K/AKT信号通路的影响，探讨金龙蛇颗粒抑制胃癌淋巴转移的机制。
[实验方法]
本文采用金龙蛇颗粒药物血清及生理盐水血清，分别对淋巴管内皮细胞进行刺激。首先，应用Matrigel基质胶进行淋巴管内皮细胞体外成管实验，观测金龙蛇颗粒药物血清对体外成管的影响;其次，应用流式细胞技术进行凋亡实验，检测金龙蛇颗粒药物血清对淋巴管内皮细胞凋亡活动的影响。第三，Trancewell法进行迁移实验，观测金龙蛇颗粒药物血清对淋巴管内皮细胞迁移行为的影响;同时，免疫印迹法检测PI3K、Akt蛋白的表达量变化。
[实验结果]
结果发现:1.金龙蛇颗粒药物血清对HLECs体外成管能力抑制较明显:10％生理盐水组、10％金龙蛇颗粒药物血清组HLECs体外成管的小管总长度分别是7058.9251±4567.3904μm、3084.4906±326.2688μm，两组之间存在显著统计学差(P＜0.05);2.金龙蛇颗粒药物血清对HLECs体外凋亡能力影响不明显:10％生理盐水组、10％金龙蛇颗粒药物血清组HLECs平均凋亡率％分别是4.990±0.139％、4.897±0.345％，两组之间无统计学差异(P＞0.05);3.金龙蛇颗粒药物血清对HLECs迁移能力有较好的抑制作用:10％生理盐水组、10％金龙蛇颗粒药物血清组迁移的细胞数分别是160±36、99±41，两组之间存在统计学差异(P＜0.05);4.金龙蛇颗粒药物血清对PI3K、P-Akt蛋白表达影响较明显:10％生理盐水组、10％金龙蛇颗粒药物血清组PI3K、p-Akt两组之间差异明显。
[结论]
1.金龙蛇颗粒对HLECs体外形成微淋巴管有较好的抑制作用。
2.金龙蛇颗粒对HLECs的迁移能力有较好的抑制作用。
3.金龙蛇颗粒作用于，降低PI3K/Akt通路蛋白的表达，使PI3K/Akt信号通路的活性得到抑制，可能是其抑制肿瘤淋巴转移的分子生物学机制。