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斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)隶属于辐鳍鱼纲(Actinopterygii),鲈形目(Perciformes),(鳍)科(Serranidae),石斑鱼属(Epinephelus)。因其生长速度快、味道鲜美、市场销售价格高等,成为亚洲东南部热带海域一种重要的海水经济鱼类。斜带石斑鱼在性腺发育过程中呈现独特的先雌后雄性反转的现象,与斜带石斑鱼性别分化和性别调控机制相关的研究吸引了越来越多学者的目光。但是斜带石斑鱼生殖细胞特化、迁移及分化相关的报道还很少。生殖细胞发育及生殖细胞标记基因的研究为进行鱼类生殖工程奠定了基础。 在本研究中,我们从斜带石斑鱼中克隆了4个nanos(Ecnanos)基因。其中Ecnanos1a和Ecnanos1b主要在脑和垂体中表达,并在进化的过程中发生了亚功能化。在斜带石斑鱼性反转过程中,垂体里Ecnanos1a的表达量显著上调,暗示着Ecnanos1a可能与精巢的分化和精子的发生有关。Ecnanos2在斜带石斑鱼生殖干细胞中特异表达,可能是生殖干细胞标记基因。Ecnanos3是斜带石斑鱼原始生殖细胞和雌性生殖细胞标记基因,可以用来追踪原始生殖细胞的特化、迁移和分化。我们揭示了斜带石斑鱼nanos相关基因在原始生殖细胞形成和生殖细胞发育中可能发挥的作用,这为利用Ecnanos2进行生殖干细胞相关操作及利用Ecnanos3进行原始生殖细胞相关操作奠定了基础。 另外,我们还克隆了斜带石斑鱼dead end(Ecdnd)基因,利用荧光定量PCR和RNA原位杂交揭示了Ecdnd在生殖细胞中特异表达。在斜带石斑鱼性腺发育的过程中,Ecdnd呈现动态的性别差异表达。随着性反转的发生,Ecdnd在性反转早期的性腺中表达量显著上调,在性反转末期性腺中表达量达到峰值,性反转完成后,成熟精巢中的表达量下调。通过注射antisense morpholinos(MO)我们在斜带石斑鱼胚胎发育早期敲降了Ecdnd。敲降dnd后,不会影响斜带石斑鱼原始生殖细胞的特化,但是会影响原始生殖细胞的存活。因此,Ecdnd是斜带石斑鱼生殖细胞标记基因,是维持斜带石斑鱼原始生殖细胞存活所必须的关键因子。 Ecdnd3UTR可以特异的标记斑马鱼原始生殖细胞,Ecnano33UTR可以同时标记斜带石斑鱼和斑马鱼的原始生殖细胞。这意味着3UTR对维持dnd和nanos3在原始生殖细胞中特异表达可能发挥重要作用。我们证实,Ecnanos3是miRNA-430的靶基因,它的3UTR中包含一个非典型的miRNA-430的结合位点(“GCACGTTT”)。此外,EcDnd蛋白与Ecnanos33UTR中23bp富含尿嘧啶区域(URR)结合从而抑制由miRNA-430介导的PGC中Ecnanos3mRNA的降解。