【摘 要】
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该研究根据牛肠激酶轻链(EK)的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子,人工设计合成了牛肠激酶轻链的全基因序列,克隆到比赤酵母表达载体pPICZαA中,构建了分泌型表达载体pPICZ
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该研究根据牛肠激酶轻链(EK<,L>)的氨基酸序列,选用毕赤酵母偏好密码子,人工设计合成了牛肠激酶轻链的全基因序列,克隆到比赤酵母表达载体pPICZαA中,构建了分泌型表达载体pPICZαA-EK<,L>用Sal Ⅰ线性化载体,采用电激法转化毕赤酵母GS115,筛选Zeocine抗性的阳性克隆,确定甲醇表型.对Mut<+>(甲醇快速型)和Mut(甲醇慢速型)两种菌株摇瓶培养,Western Blot检测结果表明Mut菌株表达rEK<,L>显著高于Mut<+>菌株.选取Mut菌株进行发酵工艺摸索,研究了发酵pH值、诱导碳源和诱导时间对rEK<,L>表达量的影响.结果表明,当诱导pH为6.0、诱导碳源为甲醇+甘油、培养96h后发酵上清中rEK<,L>的表达量达到350mg1<-1>,比Vozza等报道的在毕赤酵母中表达的rEK<,L>提高了30倍.采用阴离子交换层析可一步纯化rEK<,L>,100ml的发酵上清可获得15mg电泳纯的rEK<,L>.酶活测序结果表明该研究获得的rEK<,L>和天然肠激酶轻链的N端一致,证实了rEK<,L>在毕赤酵母中得到正确分泌表达.为了进一步提高rEK<,L>纯化得率,以及方便在融合蛋白切割反应后去除rEK<,L>,该研究构建了羧基末端带有6 X His纯化标签的EK<,L>表达载体pPICZαA-EK<,L>/His,并实现了在毕赤酵母中的高效分泌表达.采用金属螯合层析可更加简易获得目的蛋白.酶活分析表明rEK<,L>/His和rEK<,L>具有相似的活性.在成功表达rEK<,L>的基础上,该研究尝试了rEK<,L>作为融合蛋白切割试剂,在融合蛋白表达系统中的应用.总之,rEK<,L>/His和rEK<,L>的高效表达,简单经济的纯化步骤为其大规模应用奠定了良好的基础.pTRX为表达载体的融合蛋白表达系统组合重组肠激酶是重组蛋白制备及功能研究的有效平台之一.
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