【摘 要】
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为提高酒精发酵速度和发酵率，本研究将黑曲霉Aspergillusniger的酸性α—淀粉酶基因(acidalpha-amylase-encodinggene，acid-amy)和糖化酶基因(glucoamylase-encodinggene，glaA)，
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为提高酒精发酵速度和发酵率，本研究将黑曲霉Aspergillusniger的酸性α—淀粉酶基因(acidalpha-amylase-encodinggene，acid-amy)和糖化酶基因(glucoamylase-encodinggene，glaA)，构建在同一个酵母整合型载体上，并通过与含G418抗性标记的自主复制型质粒对酒精生产酵母菌株2.346的共转化，将acid-amy和glaA同时整合在其染色体上，建成能同时分泌表达酸性α-淀粉酶和糖化酶的acid-amy/glaA双功能工程菌。
首先通过聚合酶链式反应(PCR)技术从黑曲霉cDNA文库扩增acid-AMY的cDNA序列，将其置于酵母ADH1的启动子和终止子间，构成acid-amy表达元件，与由PGK引导表达的glaA表达元件同时克隆到酵母整合型载体上建成双基因表达质粒pWAG。将该质粒线性化后，与含G418抗性标记的自主复制型质粒pBEJ16共转化酒精酵母2.346菌株，将acid-amy和glaA整合在酵母染色体的rDNA序列中。将G418抗性的转化子接到淀粉培养基平板上，用碘蒸汽染色的方法检出七株产生透明水解圈的菌株。培养液的酶分析表明均为分泌酸性α-淀粉酶和糖化酶的菌株。这些菌株分泌的acid-AMY最适pH为3.0～4.0，在16℃也具有一定的活性。连续转移十次，七株菌的酸性α-淀粉酶均稳定表达，但有一株菌丢失了糖化酶活性。
实验结果表明，将两种外源基因克隆在一个表达载体上，同时整合到酵母的染色体上，能够成功获得双功能工程酵母，两外源基因不会明显影响彼此的表达。但由于酵母有可能通过重组机制将其染色体上的外源基因切除或破坏，。因此为满足工业生产的需要，需进一步连续传代，从中筛选出稳定的双功能菌株。
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