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近年来，在肿瘤领域研究的重大进展之一是确立了肿瘤血管生成在肿瘤发生发展过程中的重要作用及意义。相关抗肿瘤血管生成药物也孕育而生，如贝伐单抗、舒尼替尼、索拉非尼等。然而，在临床运用中因所取得的疗效有限，出现耐药，甚至无效，患者所获得的生存期有限，并最终出现肿瘤侵袭和转移，科学家也逐步认识到肿瘤缺氧微环境对肿瘤血管生成的影响，并影响抗肿瘤血管生成药物的作用。
现代肿瘤研究中，中医药，亦为肿瘤防治的一种重要策略。研究发现，活血化瘀中药对肿瘤血管生成有重要作用。本课题组在前期，已有相关研究证实水蛭具有抗肿瘤血管生成的作用。故本课题欲进一步从肿瘤缺氧微环境探索水蛭在抗肿瘤血管生成中可能的作用机制，以期为水蛭抗肿瘤研究开辟新的探索途径，为临床运用提供一定的理论依据。
目的：探讨水蛭能否通过改善肿瘤细胞缺氧微环境来抑制肿瘤血管生成及其相关机制研究。
方法：采用氯化钴模拟化学缺氧。在缺氧条件下，采用MTT法观察水蛭含药血清对EA.Hy926细胞的增殖抑制作用;采用RT-PCR法检测缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA、血管内皮生长因子(VEGF) mRNA的表达;WesternBlotting法检测HIF-1α蛋白水平;Matrivgel基质胶模拟体外小管形成实验检测小管生成情况。
结果：
1、缺氧条件下，水蛭含药血清对EA.hy926细胞增殖作用的影响首先设定水蛭含药血清浓度梯度0、5％、15％、25％、35％、45％，观察水蛭含药血清对EA.hy926细胞增殖作用的影响，发现水蛭含药浓度超过35％时细胞明显死亡，可能是药物本身的理化毒性对细胞有影响;水蛭含药浓度在25％时的抑制作用尚无15％浓度的作用显著，可能是由于含药血清中血清的含量亦较高，其抑制作用和促进作用相抵所致;在5％和15％浓度组，其抑制作用随时间延长而逐渐增强，因此以5％和15％浓度组分别作为低、高剂量组。从作用时间上看，在不同水蛭含药血清浓度下，对EA.hy926细胞增殖的抑制率呈现时间依赖性。虽然36h和48h同样有明显的抑制作用，但对于48h的显著抑制作用考虑可能也存在细胞本身凋亡增加，因此后续试验选择药物作用后36h的时间点观察。
2、缺氧条件下，水蛭含药血清对EA.hy926细胞HIF-1αmRNA和VEGFmRNA表达的影响缺氧条件下，EA.hy926细胞在水蛭高、低剂量组作用后HIF-1αmRNA和VEGFmRNA的表达明显降低，分别为0.33±0.10、0.50±0.12，0.76±0.14、0.92±0.05，与阴性对照组相比有显著性差异（F=47.55、19.22，P=0.00、0.001）。水蛭高剂量组在HIF-1αmRNA的表达上与阳性对照组的表达水平相当，差异无显著性（t=0.36，P=0.74），同时，高剂量组在VEGFmRNA的表达上较阳性对照组表达的水平更低，两组间差异有显著性（t=2.95，P=0.04）。这说明缺氧时水蛭能抑制HIF-1αmRNA的表达并且能显著抑制由HIF-1α所介导的靶基因VEGFmRNA的表达。
3、缺氧条件下，水蛭含药血清对EA.hy926细胞HIF-1α蛋白水平的影响在缺氧条件下，各实验组EA.hy926细胞HIF-1α蛋白条带，以β-actin为内参对照，各组灰度值分别为2.84±0.71、5.12±0.04、5.34±0.28、3.67±0.36。与阴性对照组相比，高、低剂量水蛭组HIF-1α蛋白条带灰度明显变浅，差异有极显著性（F=23.85，P=0.00）;水蛭高剂量组与阳性对照组条带灰度相当，差异无显著性（t=1.33，P=0.25），但比水蛭低剂量组的条带灰度浅，差异有显著性（t=6.37，P=0.003）。这表明水蛭能抑制缺氧条件下HIF-1α蛋白的合成，且高剂量组的抑制作用更为明显。
4、缺氧条件下，水蛭含药血清对EA.hy926细胞小管形成的影响内皮细胞具有在体外分化形成血管样结构的能力。故将EA.hy926细胞铺于Matrivgel基质胶上进行培养，模拟血管形成。在缺氧时，给予水蛭含药血清作用36h后，EA.hy926细胞连接形成小管状结构，且计数每个视野下的小管数，高、低剂量组分别为4.4±0.4、4.6±0.6，与阴性对照组（7.0±1.0）相比，小管数明显减少，差异有显著性（F=8.94，P=0.006），与阳性对照组(5.2±0.6)相比，差异无显著性（F=1.77，P=0.25）。说明水蛭具有在缺氧条件下抑制小管形成的作用。
结论：
1、缺氧条件下，水蛭能明显EA.hy926抑制细胞增殖，且呈时间和剂量依耐性。
2、缺氧条件下，水蛭能抑制HIF-1αmRNA的表达并且能显著抑制由HIF-1α所介导的靶基因VEGFmRNA的表达。
3、缺氧条件下，水蛭能抑制HIF-1α蛋白的合成，且高剂量组的抑制作用更为明显。
4、缺氧条件下，在体外小管形成实验中，水蛭使EA.hy926细胞小管形成数目减少，以高剂量组作用明显。
说明虫类中药水蛭能通过改善肿瘤缺氧微环境抑制肿瘤血管生成来发挥抗肿瘤作用，其机制可能是通过降低HIF-1α蛋白水平和mRNA的表达，以及降低由HIF-1α所介导的靶基因VEGFmRNA的表达实现的。