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目的： 心肌梗塞后及时恢复缺血区的血供（再灌注）是挽救缺血心肌的必需步骤，但该过程中伴随着严重再灌注损伤的发生，再灌注初期活性氧(reactive oxygen species，ROS)的大量释放被认为是造成这一损伤的主要因素之一，然而，ROS同时也作为启动者介导了缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)和后处理(ischemic postconditioning，IPoC)等措施对抗心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤的保护作用，ROS这种相互矛盾的双重作用，其内在机制如何，尚未报道。间歇性低氧(intermittent hypobaric hypoxia，IHH)适应是指机体间断地、定期地经受一定程度的低压低氧刺激后所获得的累积性效应。以往的研究表明，IHH适应的心脏具有显著的抗心脏顿抑、细胞凋亡和坏死、心律失常，改善心脏收缩功能等效应。与缺血预处理(ischemia preconditioning，IPC)相比，IHH具有保护效应持续时间长、副作用少、可操作性强等优点而成为目前心血管研究热点之一。尽管IHH对缺血及再灌注损伤到心肌保护效应已经非常明确，但是对其作用机制的了解远未阐明。为了进一步揭示其作用机制、寻找可能的缺血性心脏病治疗靶点，为IHH临床应用提供可靠的理论依据，本研究旨探讨IHH对缺血/再灌注过程中增强的ROS释放以及上调的热休克蛋白(Heat shock protein27，Hsp27)及其线粒体转位的作用及其分子机制。 方法： 雄性SD大鼠（280-320克）随机分为对照组、H2O2PC、H2O2PoC组，利用Langendorff灌流模型，进行30分钟缺血/45分钟再灌注，观察记录心功能指标的变化。收取缺血前、缺血后和再灌注后左心室心肌组织，利用western blot方法检测心肌组织中ERstress指标和AKT、GSK-3β、PKCε的信号通路激活情况。为了进一步验证ERstress指标和AKT、GSK-3β、PKCε不同浓度H2O2预处理和后处理模型中的作用，我们选择了ERstress的抑制剂(4-PBA)和激动剂(TM)，以及PI3K信号通路抑制剂WB和PKCε抑制剂εV1-2进行干预后，检测其对心功能指标的变化。 关于IHH心肌保护作用方面研究，雄性SD大鼠随机分为常氧组(normoxia)和IHH组，IHH组于低压氧舱接受28天相当于5000m海拔高度的低压低氧处理，每天4h。处理结束后分离normoxia组和IHH组大鼠心脏，利用Langendorff灌流模型，进行30min缺血继之45min再灌注，观察记录心功能指标的变化。收取缺血前和再灌注后左心室心肌组织，利用western blot方法检测心肌组织线粒体组分和胞浆组分中Hsp27的含量，并采用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，co-IP)方法分析线粒体组分中Hsp27蛋白与ATP5a1蛋白的相互作用。分别构建线粒体定位过表达Hsp27(Ad MtHsp27)和线粒体定位过表达并且N端缺失Hsp27过表达(Ad△N MtHsp27)腺病毒载体并感染大鼠心脏和原代分离的心肌细胞，检测缺血/再灌注过程中心脏收缩舒张功能和心肌坏死以及心肌细胞收缩功能和钙瞬变，评价线粒体中Hsp27对缺血/再灌注过程中心脏/心肌细胞收缩功能和心肌细胞存活的影响。为进一步研究线粒体Hsp27对缺血/再灌注过程中心肌细胞线粒体功能的影响，我们利用心肌细胞模拟缺血（20分钟）/再灌注(30分钟)模型，用TMRE荧光染料分别实时监测线粒体线粒体膜电位（mitochondrial membranepotential，△Ψm）的变化。同时利用ATP浓度检测试剂盒和ATP合成酶活性检测试剂盒，评价心肌细胞ATP含量的稳态变化。并且利用Seahorse XF24细胞能量代谢分析仪，评价了心肌细胞线粒体呼吸链的活性变化。 结果： H2O2PC和PoC均浓度依赖地改善了缺血/再灌注后左心室功能的恢复，该保护效应只在中等浓度(10-100μmol/L)时出现，低浓度(1-3μmol/L)及高浓度(1mmol/Lol/L)H2O2均加重了心脏功能的恢复，Western blot结果显示，中等浓度H2O2PC和PoC显著激活了心肌缺血/再灌注后PI3K-Akt-GSK-3β以及PKCε的磷酸化水平。然而，低浓度H2O2(1-3μmol/L)PC和PoC已显著上调了心肌缺血/再灌注后ER stress相关蛋白的表达，并且ER stress水平已经达到顶峰，ERstress的激动剂TM亦并不能进一步加重ER stress的水平，但是ER stress的抑制剂4-PBA可以显著减轻低浓度H2O2(1μmol/L)PC和PoC的损失作用;同时Akt的抑制剂Wortmannin和PKCε的抑制剂εV1-2均消除了H2O2PC和PoC的心肌保护作用; 另一方面，IHH可以显著保护心肌的功能以及线粒体的氧化呼吸链的功能，保存线粒体的膜电位，同时首次发现IHH可以促进Hsp27由胞浆向线粒体中的转位。通过密度梯度离心，将线粒体组分进行亚组分分离后进行WesternBlot分析，发现存在于线粒体中的Hsp27主要分布于线粒体的基质中，少量分布于线粒体外膜。进一步的Co-IP实验发现，Hsp27向线粒体转位途径依赖于Hsp90-Tom20经典线粒体转运途径，并且Hsp27在线粒体中可以与ATP5a1发生相互作用，并且此相互作用完全依赖于Hsp27的N端结构域。利用腺病毒介导的线粒体定位过表达Hsp27可以显著保护I/R损伤后心脏的收缩功能，减少心肌的坏死，并且显著减轻了I/R损伤对线粒体的膜电位以及氧化呼吸链的损伤。其次，通过构建N端缺失的线粒体定位过表达Hsp27，感染IHH适应后的大鼠心脏，发现与感染对照腺病毒相比，感染N端缺失的线粒体定位过表达Hsp27腺病毒的大鼠，经过Langendorff灌流模型（30min/45min）之后，心脏收缩功能明显降低，心肌坏死水平显著升高，与此同时，线粒体的膜电位及氧化呼吸链指标也受损更加严重。 结论： 首先，研究结果揭示ROS诱导的心肌保护作用存在浓度阈值，达到该阈值的ROS可以有效激活Akt和PKCε等护性信号通路。然而正常心肌再灌注初期所释放的ROS并不是过量的爆发，其浓度低于可激发心肌保护作用的阈值，但该低浓度的ROS可以造成心肌细胞内质网应激的完全激活，进而导致损伤。另一方面，研究发现IHH改善的心肌缺血/再灌注损伤后心脏的收缩功能和线粒体的能量代谢与线粒体中升高的Hsp27的蛋白水平有关，Hsp27向线粒体中的转位依赖于Hsp90-Tom20的转运方式;并且线粒体中Hsp27参与IHH的心肌保护作用以来与Hsp27通过N端基序与ATP合成酶的alpha亚基ATP5a1相互作用，维持ATP合成酶以及线粒体呼吸链的功能。