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本文主要从以下几个部分进行论述： 第一部分 TNF-α/RIP3在金黄色葡萄球菌感染A549细胞诱导细胞损伤中的作用及机制研究 目的： 1.研究TNF-α对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus，以下简称金葡菌）感染A549细胞诱导细胞损伤的作用及机制; 2.探讨受体结合蛋白3(receptor-interacting protein，RIP3)在金葡菌感染A549细胞诱导细胞损伤中的作用。 方法： A549细胞传代后接种于96孔板、6孔板或培养瓶，含10％胎牛血清的RPMI1640培养液培养细胞，待细胞生长至约90％皿底面积时，金葡菌感染细胞以建立细胞感染模型，细菌感染前24h改用无双抗RPMI1640培养基培养细胞。 1.金葡菌感染对细胞活力的影响 金葡菌以不同感染分数（multiplicity of infection，MOI）分别为(0、1、5、25、50、100)感染A549细胞，于感染6h终止，乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)释放试验检测细胞活力;金葡菌(MOI25)感染A549细胞，分别于感染2h、6h、12h、24h终止，LDH释放试验检测细胞活力。 2.TNF-α对A549细胞活力的影响 不同浓度TNF-α（0、10、50、100ng/ml）处理细胞6h，LDH释放试验检测细胞活力。 3.透射电镜观察金葡菌和TNF-α引起的A549细胞亚显微结构变化 金葡菌(MOI25)和TNF-α（50ng/ml）处理A549细胞，设对照组、SA组（金葡菌感染组）、TNF-α组和SA+TNF-α组（金葡菌感染同时加TNF-α处理细胞），各组细胞予相应处理12h，采用透射电镜观察细胞亚显微结构变化。 4.流式细胞术和western blot检测TNF-α和金葡菌对A549细胞的损伤作用 金葡菌(MOI25)感染A549细胞，实验设对照组、SA组（金葡菌感染组）、TNF-α组（50ng/ml TNF-α处理细胞）、TNF-α+抗TNF-α抗体组（TNF-α联合抗TNF-α抗体500ng/ml中和TNF-α处理细胞）、SA+TNF-α组（金葡菌感染同时加TNF-α处理细胞）和SA+TNF-α+抗TNF-α抗体组（金葡菌感染加TNF-α联合抗TNF-α抗体处理细胞）。各组细胞予相应处理12h，流式细胞术检测细胞凋亡/坏死情况，western blot检测细胞RIP3、激活型半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶-1(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase-1, cleaved caspase-1)和cleavedcaspase-8蛋白表达。 结果： 1.金葡菌以MOI和感染时间依赖性方式影响A549细胞活力 MOI增加，细胞活力降低。感染6h，金葡菌(MOI25)组A549细胞细胞死亡率较对照组相比显著升高(P＜0.01)。随金葡菌感染时间延长，A549细胞活力降低。金葡菌(MOI25)，感染6h，细胞死亡率较对照组显著升高(P＜0.05)。 2.TNF-α对A549细胞活力的影响 TNF-α处理A549细胞6h，与对照组相比，TNF-α（100 ng/ml）组细胞死亡率显著升高(P＜0.01)，而TNF-α(10、50 ng/ml)组均无显著差异(P＞0.05)。 3.金葡菌和TNF-α引起A549细胞亚显微结构改变 金葡菌(MOI25)和/或TNF-α（50ng/ml）处理A549细胞12h，透射电镜观察到SA组和TNF-α组部分细胞呈凋亡表现;SA+TNF-α组部分细胞呈晚期凋亡、坏死状态。 结论： 1.金葡菌感染A549细胞可诱导细胞凋亡。 2.RIP3依赖的程序性坏死参与金葡菌感染A549细胞诱发的细胞损伤。 3.TNF-α增强金葡菌对A549细胞的损伤作用，其机制与诱导细胞凋亡和激活RIP3依赖的程序性坏死有关。 第二部分 地塞米松佐治小鼠金黄色葡萄球菌肺部感染及RIP3表达研究 目的： 1.探讨地塞米松佐治小鼠金葡菌肺部感染的作用及机制; 2.观察RIP3在小鼠金葡菌肺部感染中的表达。 方法： 1.地塞米松佐治小鼠金葡菌肺部感染模型建立及分组 小鼠用1.5％浓度的戊巴比妥钠(0.1ml/20g)腹腔注射麻醉，经27号针气管插管，肺部感染模型组滴入50μl金葡菌菌液（约5.0×108 CFU）。随机分为金葡菌感染组（SA组），金葡菌感染+苯唑西林组（OX组），金葡菌感染+苯唑西林+低剂量地塞米松组[OX+DEX(1)组]，金葡菌感染+苯唑西林+中剂量地塞米松组[OX+DEX(2.5)组]，金葡菌感染+苯唑西林+高剂量地塞米松组[OX+DEX(5)组]。各分48h和120h亚组。金葡菌肺部感染及干预组（分别为15只/48h亚组和10只/120h亚组）。对照组（PBS组）气管滴入50μl无菌磷酸盐缓冲生理盐水（phosphate bufferred saline，PBS）。PBS组及SA组:腹腔注射生理盐水(normalsodium，NS);OX组:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次。OX+DEX(1)组:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次，联合地塞米松(1mg/kg/d)，每天1次;OX+DEX(2.5)组:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次，联合地塞米松(2.5mg/kg/d)，每天1次;OX+DEX(5)组:腹腔注射苯唑西林(1600mg/kg/d)，每天4次，联合地塞米松(5mg/kg/d)，每天1次。造模30min后予注射苯唑西林，再过2h予注射地塞米松。 2.小鼠肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid，BALF)标本留取 水合氯醛麻醉法处死存活小鼠，逐层开胸，分离肺组织，丝线结扎左主支气管，再切开气管，用20号针头行气管插管，丝线固定，经气管行右肺灌洗，用1ml无菌PBS分2次于气管插管处注入，缓慢冲洗右肺3次，可回收约0.8ml。 3.肺组织细菌载量 在无菌条件下，将未经灌洗的小鼠右肺组织置于研磨器中，加入2ml无菌PBS缓冲液研磨至无肉眼可见的组织块。将匀浆液连续倍比稀释并接种于胰蛋白胨大豆琼脂(tryptic soy agar，TSA)平板，37℃培养24h，计数平板菌落数。 结果： 1.肺组织细菌载量 气管滴入造模48h，OX+DEX(1)组、OX+DEX(2.5)组较OX组肺匀浆细菌载量无显著差异，而OX+DEX(5)组细菌清除率降低。 2.肺组织HE染色及MPO阳性细胞浸润 气管滴入造模48h，肺组织HE染色可见肺泡腔、细支气管腔大量炎性细胞浸润及蛋白水肿液渗出、肺泡结构破坏;OX+DEX(2.5)组和OX+DEX(5)组半定量病理学评分较OX组显著降低;造模120h，OX+DEX(2.5)和OX+DEX(5)组半定量病理学评分较OX组低。造模48h，免疫组化示SA组和OX组小鼠的肺泡及肺间质有大量MPO阳性细胞浸润，而OX+DEX(2.5)和OX+DEX(5)组小鼠肺组织中仅有少量MPO阳性细胞浸润。 3.BALF中总蛋白含量和sRAGE水平 造模48h，SA组小鼠BALF中的总蛋白显著升高，而OX+DEX(2.5)组较OX组低;SA组小鼠BALF中sRAGE(210.1±26.8ng/ml)较PBS组(4.5±0.2ng/ml)约升高46倍，而OX+DEX(2.5)组和OX+DEX(5)组BALF中sRAGE浓度分别为135.7±28.2(ng/ml)和140.8±21.3(ng/ml)，较OX组(181.6±16.1ng/ml)低。 4.BALF中白细胞数，中性粒细胞数，TNF-α、KC、IL-6、IL-10蛋白水平及其肺组织mRNA表达 造模48h，OX组小鼠的BLAF白细胞和中性粒细胞较SA组无显著性差异;而OX+DEX(2.5)组和OX+DEX(5)组BLAF白细胞和中性粒细胞数均较OX组低。OX+DEX(2.5)组和OX+DEX(5)组BALF中的TNF-α、KC和IL-6蛋白水平较OX组降低。同时，OX+DEX(2.5)组和OX+DEX(5)组肺组织中的TNF-α、KC和IL-6的mRNA水平较OX组显著下调。 5.金葡菌肺部感染小鼠肺组织RIP3、caspase-8、cleaved caspase-8蛋白表达情况 造模48h，SA组小鼠肺组织表达RIP3较PBS组升高; OX+DEX(1)和OX+DEX(2.5)组RIP3表达水平较OX组低，而cleaved caspase-8各组无显著性差异。 结论： 1.金葡菌肺部感染诱导小鼠肺组织RIP3蛋白表达上调。 2.地塞米松(2.5mg/kg/d)佐治小鼠金葡菌肺部感染对肺组织有保护作用，其机制可能与抑制炎症反应和下调RIP3蛋白表达有关。