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角质形成细胞(KCs)为皮肤表皮的主要组成细胞,是机体直接与外界环境接触,最先接触外来抗原的细胞。研究发现,KCs不仅形成机体的物理屏障,同时具有重要的免疫功能。KCs在一些疾病的状态下或者直接受到干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子的刺激后,可以表达抗原提呈相关分子如主要组织相容性复合体-II(MHC-II)、细胞间粘附分子-1(ICAM-1)等,同时主要组织相容性复合体-I(MHC-I)也会较刺激前增高。上述改变使得KCs具备了发挥抗原提呈功能的先决条件。以往的研究仅仅证明活化后的KCs具备了发挥抗原提呈的条件,如表达一些专职抗原提呈细胞(professional APC)所特有的分子,或者利用动物实验间接证明了KCs发挥了抗原提呈的功能,但均未能拿出有说服力的直接证据。本研究通过利用流式细胞学、免疫共沉淀、质谱鉴定、Elispot等实验直接证明了KCs在活化状态下可以作为APC发挥抗原提呈功能。目的:证明KCs在特定条件下可以发挥抗原提呈功能,鉴定KCs提呈抗原肽的序列及其MHC限制性。方法:1.刺激Ha Ca T细胞表达抗原提呈相关分子:用细胞因子IFN-γ刺激人永生化角质形成细胞系(Ha Ca T细胞)致使其活化;2.质谱鉴定抗原肽:分别利用MHC-I、MHC-II单克隆抗体对活化后Ha Ca T细胞胞浆及包膜表面的主要组织相容性复合体-肽段复合物(MHC-peptide complex)进行免疫共沉淀(Co-IP),用PH3.0的酸液对共沉淀下来的MHC-肽段复合物进行解离,后经超滤管离心将两者分离,通过银染及蛋白印迹(Western blot)来验证免疫共沉淀的特异性,质谱判定MHC上所加载的肽段及其蛋白来源;3.共孵育实验:检测Ha Ca T细胞MHC-I和MHC-II每个基因座分型,根据质谱鉴定的肽段结果预测目的MHC等位基因;流式细胞术分选7例银屑病病人外周血CD4+T细胞及CD8+T细胞,将IFN-γ刺激或未刺激Ha Ca T细胞分别与分选的T细胞共孵育,酶联免疫斑点测定法(Elispot)观察T细胞活化情况;4.MHC限制性验证:测序鉴定上述共孵育实验阳性患者MHC分型,与肽段预测结果比对,验证KCs抗原提呈的MHC限制性。结果:Ha Ca T细胞受到IFN-γ刺激后膜表面出现MHC-II、ICAM-1的表达,MHC-I表达较刺激前增高,且随着IFN-γ刺激浓度及时间的增加,MHC-I、MHC-II的表达呈剂量和时间依赖性增高。在保证抗原提呈相关分子表达较高及Ha Ca T细胞状态较佳的情况下,选取了IFN-γ最佳刺激浓度及刺激时间(400U/ml,48h)。Co-IP实验及质谱分析结果显示:银染及Western blot证实MHC抗体可以特异性地沉淀出MHC蛋白。质谱成功鉴定出MHC上加载肽段及其蛋白来源,包括来自胞内的角蛋白、核糖体蛋白、组蛋白等。无刺激的或IFN-γ刺激的Ha Ca T细胞分别与7例银屑病病人的CD4+T细胞及CD8+T细胞共孵育后发现,IFN-γ刺激后的Ha Ca T细胞可以使1例银屑病病人的CD4+T细胞活化,无IFN-γ刺激组的CD4+T细胞及CD8+T细胞均未活化。结论:KCs经IFN-γ刺激后可以表达专职APC如树突状细胞(DCs)、巨噬细胞(MΦ)、B淋巴细胞(B cells)所特有的MHC-II、ICAM-1等分子,MHC-I表达也较刺激前明显增高,说明刺激后的KCs具备了发挥抗原提呈的条件。质谱鉴定结果表明IFN-γ刺激后,KCs的MHC-I、MHC-II抗原结合槽中加载了肽段。共孵育实验说明活化后表达加载肽段的MHC-II分子的KCs可以活化特异性T细胞,而未活化的KCs没有这种功能。