论文部分内容阅读
防御素(Defensins)是生物界中发现的一类富含半胱氨酸的阳离子内源性抗菌肽,具有广谱的抗微生物活性,在生物体的免疫反应中发挥着重要的作用。本研究选用益生性酿酒酵母菌研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(Ruminal Epithelial Cells, RECs)p-防御素-1(Sheep-Beta-Defensin-1, SBD-1)表达的影响及其可能的信号转导途径。首先建立绵羊RECs培养体系作为体外试验模型,用不同浓度酿酒酵母菌对体外培养的绵羊RECs刺激2 h后分别进行不同时间的诱导培养,利用实时荧光定量逆转录PCR技术(Realtime fluorescence quantitative PCR, RT-qPCR)和酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)试验研究接受刺激后RECs SBD-1 mRNA和蛋白表达的差异,以确定酿酒酵母菌对SBD-1表达影响的量效和时效关系。然后选用诱导SBD-1表达最高的菌液浓度和诱导培养时间进行后续的信号通路初步研究,采用核因子-kB (Nuclear.factor-kappa B, NF-kB)和丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases, MAPKs)的4种特异性抑制剂通过单独或组合对各通路中的关键因子进行抑制,利用RT-qPCR技术检测抑制前后SBD-1 mRNA的表达量及其信号通路中各因子在酿酒酵母菌刺激前后(TLR-2、MyD88、NF-kB、P38、 JNK、ERK1/2) mRNA的表达变化。结果表明：无论在mRNA还是蛋白水平,酿酒酵母菌均能够诱导绵羊RECsSBD-1的表达,且菌液浓度为5.2×107CFU·mL-1诱导培养RECs 12 h时,SBD-1的表达量达到最高。4种特异性抑制剂无论是单独还是组合对各通路进行抑制,其抑制效果依次表现为SB202190> PDTC> SP600125> PD98059,且信号通路中各因子mRNA在酿酒酵母菌刺激后均有变化。因此,酿酒酵母菌诱导绵羊RECs SBD-1的表达可能与TLR2-MyD88-NF-kB/MAPKs通路有关,但可能以TLR2-MyD88-MAPKs中的TLR2-MyD88-P38通路为主。