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二氢叶酸还原酶(dihydrofolate reducase，DHFR)高表达是肿瘤细胞对氨甲蝶呤(methotrexate，MTX)产生耐药的主要机制之一。MTX耐药细胞系中常常出现DHFR基因扩增伴随与其共用一个启动子但是反方向转录的hMSH3基因的扩增现象。作为共扩增的结果，hMSH3蛋白的过表达会扰乱错配修复系统(mismatch repair，MMR)的功能，对于一些由MMR系统成分hMutSα识别其细胞毒性作用的化疗药物，这种MMR功能的缺失会通过破坏细胞识别DNA损伤和激活凋亡的能力从而降低肿瘤细胞对药物的敏感性而产生耐药。迄今，人们尚未对此问题在肿瘤细胞系中进行深入的研究。本研究在人结肠癌MTX耐药细胞系HT-29/MTX和人骨肉瘤MTX耐药细胞系U-2OS/MTX中分析了DHFR和hMSH3基因共扩增的现象，并利用梯度耐药细胞系系统地探讨了DHFR和hMSH3基因的共扩增对MMR系统功能的改变和对化疗药物敏感性的影响。
本研究中，首先通过MTX浓度梯度递增的方法体外诱导建立了两组MTX耐药细胞系HT-29/MTX和U-2OS/MTX。分别应用Real-time PCR和WesternBlotting方法比较敏感细胞系和耐药细胞系中DHFR、hMSH3、hMSH2和hMSH6在DNA和蛋白水平上的差异；同时应用荧光原位杂交方法(fluorescence in situhybridization，FISH)检测DHFR和hMSH3基因共扩增的形式；为分析细胞MMR功能的变化，分别应用微卫星分析(microsatellite analysis)比较敏感细胞系和耐药细胞系之间基因组不稳定性情况的改变以及MTT法比较敏感细胞系和耐药细胞系对6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、替莫唑胺(temozolomide)、阿霉素(doxorubicin)和紫杉醇(paclitaxel)的药物敏感性差异。
结果表明，在两组MTX耐药细胞系中均存在DHFR和hMSH3基因的共扩增现象，但是由于hMutSα缺失而引起对6-硫鸟嘌呤，替莫唑胺和阿霉素的交叉耐药仅出现在HT-29/MTX耐药细胞系中。说明随着MTX耐药程度的增高，DHFR和hMSH3基因共扩增引起的hMSH3蛋白水平的逐渐升高影响了MMR相关蛋白的表达从而引起了hMutSα功能的缺失，并引起了对一些由hMutSα识别其细胞毒性作用的化疗药物的交叉耐药。U-2OS/MTX耐药细胞系中DHFR和hMSH3基因的共扩增现象并不伴随hMSH6蛋白的低表达以及对多种化疗药物的交叉耐药现象，可能是由于hMSH3蛋白的高表达程度不足以影响其hMutSα的功能。本研究证明了在MTX耐药的肿瘤细胞中，DHFR和hMSH3基因共扩增是引起细胞多药耐药现象的机制之一。