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目的:
支气管肺发育不良(Bronchopulmonarydy splasia,BPD)是发生于早产儿的一种常见慢性肺疾病。一般认为BPD的发生是与长期的机械通气和辅助用氧有关,然而越来越多的证据表明围生期的宫内感染(Intrauterineinfection)可能在BPD的发病中亦起着关键作用,宫内感染通过影响肺泡细胞的死亡和炎症反应来发挥作用。
目前国外研究发现宫内感染的病原体主要是革兰阴性菌,主要致病成分是其胞壁上的脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)。LPS可与宿主细胞表面泛特异性受体Toll样受体4(Tolllikereceptor4,TLR4)结合,通过TLR4信号转导途径,激活急性炎症反应,从而在多个环节致使宿主天然免疫系统的失衡,导致宿主肺组织处于一个适度的炎性预敏状态和肺发育的异常,在后天的因素如机械通气、高氧等共同作用下导致宿主肺组织炎性反应的增强并最终引起BPD的发生。Notch信号通路由Notch受体、配体和细胞内效应分子CSL蛋白以及Notch的调节分子等组成。在哺乳动物中共发现4类Notch基因,编码4种Notch受体,即Notch1～4。Notch受体是一种单次跨膜蛋白,其结构在进化过程中高度保守。Notch配体同样为单次跨膜蛋白,在哺乳动物中鉴别出至少5种配体:Jagged1、Jagged2、Delta1、Delta3及Delta4。Notch信号通路参与肺癌、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、肺动脉高压症等多种肺部疾病的病理过程,干预Notch信号有望阻抑这些疾病的发生及发展,为其预防和治疗提供新思路。
本研究拟使用Ⅱ型肺泡细胞(Mouse Lung Epithelial12,MLE12)和昆明小鼠E18.5肺组织为研究对象,利用LPS来建立模型,模拟宫内感染。观察Notch信号在LPS处理后的表达变化情况,随后利用Notch信号抑制剂(DAPT)来研究Notch受体对Ⅱ型肺泡细胞炎症反应及细胞死亡的作用,进而探讨Notch受体在BPD发生中的可能机制,阐述Notch抑制剂在缓解炎症反应及增加存活率的作用,为临床上治疗BPD提供方案。
方法:
1、细胞培养
2、体外培养E18.5肺切片
3、RealtimePCR
4、WesternBlotting
5、WST
6、细胞免疫荧光
7、石蜡包埋及切片
8、组织免疫荧光
9、统计分析
结果:
1、肺发育过程中Notch表达变化情况
随着肺的发育进程,Notch1、2的表达呈现升高趋势。
2、LPS处理MLE12细胞后的生物学效应
(1)60μg/mlLPS处理24小时可能导致MLE12细胞凋亡和炎症因子的大量释放,但是10μg/mlLPS却不能引起此效应。
(2)与此同时发现60μg/mlLPS处理24小时引起Notch1、Notch2表达水平升高,但是10μg/mlLPS却不能引起此效应。
3、阻断Notch信号后,LPS处理MLE12细胞后的生物学效应
(1)LPS和DAPT联合处理MLE12细胞使Notch1、Notch2表达量下降。
(2)LPS和DAPT联合处理MLE12细胞可能抑制了LPS所引起的细胞凋亡和炎症因子的大量释放。
4、LPS处理E18.5肺切片24小时后的生物学效应
(1)60μg/mlLPS处理E18.5肺切片24小时后同样能观察到炎症因子IL6及NF-κb的mRNA升高。
(2)与此同时,60μg/mlLPS处理E18.5n肺切片24dx时后发现Notch1,2的mRNA升高。
5、LPS和DAPT联合处理18.5肺切片24小时后的生物学效应
(1)LPS联合DAPT处理E18.5肺切片24小时,抑制TLPS引起的Notch2蛋白的升高。
(2)LPS联合DAPT处理E18.5n肺切片24小时,抑制了LPS引起的炎症因子IL6和NF-κbmRNA的升高。
结论:
Notch1、2参与了LPS所引起的MLE12细胞IL6和NF-κb转录水平升高的过程。