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甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)是世界第三大、中国最重要的油料作物。但我国油菜单产量不高,究其原因虫害是制约农作物高产的重要因素,世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的15％以上。化学农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作用,如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。而通过基因工程手段培育抗虫(吸虫)新品种(系)可从根本上解决问题,对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用,且不造成环境污染,具有广阔的应用前景。因此,研究甘蓝型油菜的虫害控制具有重要的战略意义。本文从硫代葡萄糖苷的主要降解产物异硫氰酸盐对害虫可能产生的吸引力着手,研究了蚜虫对转基因植株的觅食反应,为进一步开发做为“陷阱”植物的新品种奠定了基础。
本研究首次克隆得到甘蓝型油菜MAM1基因的全长cDNA序列,并构建了植物过表达载体,转化拟南芥,测试了蚜虫对转基因拟南芥的觅食反应,从而确定MAM1基因在害虫控制上的生物学功能。主要结果如下:1.序列分析用基因组步移的方法克隆到了甘蓝型油菜中双九号的MAM1基因全长cDNA。并将其命名为BnMAM1。对BnMAM1基因的序列分析表明,该cDNA开放阅读框全长1518bp,编码506个氨基酸,与拟南芥MAM1基因(AtMAM1)cDNA相似性为84％,氨基酸相似性为80.3％,确定二者有很高的同源性。
2.拟南芥的转化及筛选将BnMAM1基因克隆到植物过表达载体pCA23NS上,并转化拟南芥。得到了经卡那霉素(Kan)筛选后存活,并且PCR验证为阳性的34株转基因植株。
3.接虫实验
通过在连接转基因及野生型拟南芥的泡沫板上接种蚜虫来研究其对蚜虫的吸引力,从而确定MAM1基因在虫害控制上的生物学功能。研究结果表明,在生长状态及其他所有条件一致的情况下,转基因植株对蚜虫有着更强的吸引力。
4.RT-PCR检测用RT-PCR的方法检测了油菜不同组织中MAM1基因的表达情况,结果表明,MAM1基因是一个非组织特异性表达的基因,并且其在花和角果中的表达量最高。检测了野生型及转基因植株接虫前后的BnMAM1基因表达情况。结果表明,接虫后的转基因植株有着更高的BnMAM1表达量。
5.接虫前后植株中硫代葡萄糖苷和异硫氰酸盐含量的检测为了确定蚜虫对转基因和野生型植株觅食反应的不同是否跟植株中硫代及异硫氰酸盐含量的高低相关,我们还测试了接虫前后植株中硫代和异硫氰酸盐的含量,结果表明接虫后的植株中硫代葡萄糖苷和异硫氰酸盐含量均比接虫前高。