论文部分内容阅读
Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子通过限制内外源蛋白酶的活性、抗炎症反应和黏膜上皮的抗菌反应在先天免疫中起着重要的作用。通过对Kazal型抑制因子的研究，可加深对其抑制性质的了解，深入认识其在先天免疫中的功能，还可以开发其药用价值。
我们在中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）的肝胰腺中克隆并鉴定了四个Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子(FcSPI-1-4)。四个FcSPI的cDNA的开放阅读框(ORFs)长度分别是1389，1236，1080和939bps，演绎的蛋白的氨基酸长度分别是462，411，359和312，形成9，8，7和6个Kazal结构域。对氨基酸的序列分析表明，四个FcSPI的cDNA可能是由同一个转录本经过选择性剪切而来，并且每个cDNA内所有的结构域各不相同。多重序列比对显示，四个FcSPI的Kazal结构域有保守的基序：Cx3Cx6VCGSDGxTYx3CxLxsCxsITx6GC。结构域多的分子包含有结构域少的分子的所有结构域。由于，序列保守性较高，很难分别鉴定表达模式，所以我们设计了一对RT-PCR引物，这对引物可以从四个FSPI的cDNA中克隆到相同的片段以显示四个基因在体内的总共的表达模式。RT-PCR结果说明FcSPI的表达模式受到细菌刺激而上调，但其表达不因病毒的刺激而发生明显变化。
根据四个FcSPI成熟肽的cDNA序列，我们构建了四个表达载体FcSPIs/pGEX-4T-1，并在大肠杆菌中分别进行表达。蛋白表达在细菌裂解液的上清中，通过亲和纯化得到较纯的蛋白质。重组蛋白rFcSPI-1的抑制活性受DTT的抑制，而且有着一定的热稳定性。抑制动力学研究表明，重组蛋白rFcSPI-1是一种混合型快速紧密结合抑制因子。rFcSPI-1对枯草蛋白酶A，蛋白酶K和弹性蛋白酶的最大抑制活性大约是与该酶的分子量比分别为1:1，1:2和2:1。在细菌结合实验中，rFcSPI-1可以与两种革兰氏阳性菌和一种革兰氏阴性菌紧密结合，但是并没有抑菌活性。rFcSPI-I能抑制细菌分泌的蛋白酶和对虾免疫相关的天然糜蛋白酶。这表明，FcSPI-I既可以通过抑制细菌蛋白酶参与对虾的先天免疫反应，又可以通过抑制蛋白酶活性参与对虾免疫相关的蛋白酶调控反应。