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目的:PprI基因是一个放射性损伤修复的关键基因,其产物PprI蛋白是耐辐射球菌所专有的,能够促使RecA、PprA等DNA重组修复有关因子的显著表达。本课题组利用活体基因电转染技术,将我科室自行构建的PprI基因真核表达质粒pEGFP-c1-pprI及空载体质粒pEGFP-c1转入小鼠体内,从组织器官病理学的角度探讨PprI基因表达对γ射线急性照射动物的抗辐射作用及其机理。同时本课题组在本实验室的研究基础上对自行构建的含有PprI基因的pHBM-6×His-PprI的毕赤酵母GS115菌株转化子诱导高效表达PprI蛋白,通过进一步研究PprI蛋白的纯化方法,得到高纯度的PprI蛋白,为阐明其发挥生物效应的机制供应更多的实验材料。 材料与方法:采用BABL/c雄性小鼠,随机分为对照组、单纯照射组、空载体组和转染组。用质粒抽提试剂盒提取大肠杆菌重组质粒pEGFP-c1-pprI及空载体质粒pEGFP-c1,应用活体基因电转导技术,将PprI重组质粒及空载体质粒分别转入小鼠腿部肌纤维细胞,死亡率观察组用60Coγ射线进行全身照射,吸收剂量总计6 Gy,剂量率为2 Gy/min,病理实验组吸收剂量总计4 Gy,剂量率为2 Gy/min。观察γ射线辐射损伤对小鼠的死亡率;取小鼠心脏、肺脏、肾脏和睾丸,固定做石蜡切片,HE染色,观测γ射线辐射损伤引起小鼠在不同时间点各组织器官的病理学改变。将本实验自行构建的pHBM-6×His-PprI毕赤酵母工程菌扩大培养,添加纯甲醇至最后浓度为1％诱导蛋白表达,利用SDS-PAGE电泳,Western blot检测最终蛋白产物。通过过滤、PBS透析、金属镍螯合亲和层析等步骤纯化蛋白,SDS-PAGE电泳,Western blot再次检测最终纯化后的蛋白。 结果:6 Gy的γ射线可引起小鼠急性致死性放射损伤,转染组小鼠的死亡率为30％,与单纯照射组小鼠70％的死亡率和空载体组小鼠60％的死亡率相比显著降低。肺脏病理观测结果显示,转染组的小鼠在照后初期肺泡毛细血管的充血、水肿、炎性渗出以及照射后期肺气肿的形成、肺泡隔纤维增厚等辐射损伤表现均显著轻于其他组;肾组织病理结果显示,转染组肾毛细血管扩张充血、肾小球肿大及肾小管上皮细胞萎缩坏死程度稍轻于其他组;睾丸病理结果显示,初期各组都出现严重的辐射损伤,各级精原细胞大量变性坏死,转染组程度稍轻,在照射28天后,转染组的部分生精小管出现了新生的精原细胞,而其他组未有此改变,PprI基因可提前睾丸组织的损伤修复;心肌细胞相对射线敏感度较低未见明显损伤。通过对含PprI基因的毕赤酵母工程菌上清液的SDS-PAGE电泳、Western blot测定,表明PprI蛋白成功表达,相对分子质量约为43 kDa。上清液过滤、透析、金属镍鳌合亲和层析后蛋白成功纯化,获得较多高纯度PprI蛋白,再次采用SDS-PAGE电泳、Western blot检测证实为PprI蛋白。 结论: 1. PprI基因活体电转染在哺乳动物体内的表达可明显降低γ射线照射小鼠的死亡率。 2. PprI基因活体电转染对γ射线辐射损伤小鼠肺脏、肾脏、睾丸器官组织有抗辐射损伤和修复作用,特别是对肺脏、睾丸更为显著。 3.成功分离纯化了PprI蛋白,为批量获得高纯度PprI蛋白提供了相应的方法。