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目的:研究NAD+依赖性组蛋白去乙酰化酶sirtuin 7(SIRT7)对非小细胞肺癌(NSCLC)生长和转移的作用及其分子机制。方法:(1)收集苏州大学附属第一医院胸外科可手术肺癌患者的配对癌组织、癌旁组织标本及其临床病理资料,选择102对福尔马林固定、石蜡包埋的肺癌癌组织、癌旁组织(对照)标本制备肺癌组织芯片(TMA)(102病例、204个点;标本点样直径为1.5 mm),并采用免疫组化方法检测SIRT7的表达,分析肺癌组织中SIRT7表达水平及其与肺癌患者临床病理因素的相关性。(2)分别提取人NSCLC细胞A549、H292、H1299、H1975和人正常支气管上皮细胞 HBE(对照)的总 RNA、总蛋白,qRT-PCR(SIRT7-F1:5’-ACT TGG TCG TCT ACACAG GC-3’、SIRT7-R1:5’-GGTGATGCTCATGTG GGTGA-3’;PCR 产物大小158bp)、Western blot检测SIRT7在NSCLC细胞中的表达。(3)以携带人SIRT7编码序列(CDS)(1203bp)的pGEM/SIRT7克隆质粒为模板,利用人 SIRT7 全长特异性引物(SIRT7-F2:5‘-CTAGCTAGC GCC ACC ATG GCA GCC GGG GGT CTG AG-3‘、SIRT7-R2:5’-TTG GCG CGC CTTACG TCA CTT TCT TCC TTT TTG TGC G-3’)通过 PCR 扩增约 1203bp 的 SIRT7 CDS 目的片段,在NheI、SgsI酶切位点间插入至pLenti6.3/IRES/GFP慢病毒质粒构建人SIRT7重组慢病毒质粒pLenti6.3/SIRT7/IRES/GFP,并经PCR、双酶切、DNA测序鉴定。(4)构建的SIRT7过表达慢病毒质粒pLenti6.3/SIRT7/IRES/GFP、空慢病毒质粒 pLenti6.3/IRES/GFP 分别与辅助质粒 pLP1、pLP2、VSVG 用 Lipofectamine 2000共转染人胚肾细胞293T(慢病毒包装细胞),制备SIRT7过表达慢病毒(LV-SIRT7)、空对照慢病毒(LV)并滴度测定。(5)SIRT7相对表达低的A549NSCLC细胞分别用上述制备的50MO感染剂量的LV-SIRT7、LV(空病毒对照)感染,通过灭瘟素(BSD)药物筛选后获得SIRT7过表达A549-SIRT7、A549-mock(空病毒对照细胞);SIRT7相对表达高的H292 NSCLC细胞分别用购买的50MOI感染剂量的SIRT7 shRNA干扰慢病毒LV-shSIRT7、LV-shcontrol(干扰对照慢病毒)感染,通过嘌吟霉素(PURO)药物筛选后获得SIRT7敲减H292-shSIRT7、H292-shcontrol(干扰对照病毒对照细胞),并荧光显微镜、流式细胞仪检测慢病毒介导的转基因效率及qRT-PCR、Western blot检测SIRT7在A549细胞中的过表达效率和在H292细胞中的敲减效率。(6)通过CCK-8、平板细胞克隆形成、PI单染法细胞周期、划痕、Transwell迁移、Transwell侵袭实验,细胞模型上研究SIRT7过表达(A549-SIRT7 vs A549-mock)、敲减(H292-shSIRT7 vs H292-shcontrol)对NSCLC细胞增殖、细胞周期、迁移、侵袭的作用。(7)建立BALB/c裸鼠NSCLC皮下移植瘤和尾静脉注射肺转移模型,通过监测肿瘤体积、重量和肺转移结节,动物模型上分析在裸鼠体内SIRT7对NSCLC细胞生长、肺转移能力的影响。(8)Western blot 检测 SIRT7 过表达(A549-SIRT7 vs A549-mock)、敲减(H292-shSIRT7 vs H292-shcontrol)对 NSCLC 细胞 p-AKT(T308)、p-AKT(S473)、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2、p21、p27、Cyclin D1、Cyclin E、CDK4、CDK2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail(Snaill)、Slug(Snail2)表达的影响;免疫组化检测A549-SIRT7 vs A549-mock、H292-shSIRT7 vs H292-shcontrol NSCLC 裸鼠皮下移植瘤中上述蛋白的变化,进一步裸鼠体内验证SIRT7过表达、敲减对NSCLC细胞上述蛋白表达的影响。结果:(1)与癌旁组织比较,人肺癌组织中SIRT7表达水平明显升高,且与肿瘤大小、病理分级分期、淋巴结转移临床病理因素呈正相关(p<0.05)。与正常支气管上皮细胞比较,人NSCLC细胞中SIRT7 mRNA、蛋白表达水平也均上调(p<0.05)。(2)成功建立了 SIRT7稳定过表达NSCLC细胞株A549-SIRT7 vs A549-mock和 SIRT7 敲减 NSCLC 细胞株 H292-shSIRT7 vs H292-shcontrol。SIRT7 过表达能明显促进A549 NSCLC细胞的增殖、细胞周期G1/S期转换、迁移和侵袭;而SIRT7敲减抑制H292 NSCLC细胞的增殖、迁移、侵袭和诱导G1期阻滞(p<0.05)。SIRT7过表达也能明显促进A549 NSCLC细胞在裸鼠体内的生长和肺转移;而SIRT7敲减抑制H292NSCLC细胞在裸鼠体内的生长和肺转移(p<0.05)。(3)SIRT7过表达能在A549 NSCLC细胞及其裸鼠移植瘤中显著上调p-AKT、p-ERK1/2的水平、增强AKT、ERK信号活化,上调Cyclin D1、Cyclin E细胞周期素和CDK4、CDK2细胞周期素依赖激酶(CDK)的表达而下调p21、p27细胞周期素依赖激酶抑制剂(CDKI)的表达,及上调间充质标志物N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug的表达而下调上皮标志物E-cadherin的表达(p<0.05)。SIRT7敲减在H292 NSCLC细胞及其裸鼠移植瘤中呈现相反的效应(p<0.05)。结论:SIRT7在人肺癌中表达升高,可能通过活化AKT、ERK信号,调控细胞周期G1期检查点关键分子促进G1/S期转换,及诱导上皮间质转化(EMT)促进肺癌(NSCLC)的生长和转移。SIRT7在肺癌中具有促癌的作用,可能是肺癌的一个新的潜在治疗靶标。