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植物病毒引起的病害是植物的一种主要病害,严重影响农作物的产量和质量。如何在发病早期对植株进行快速准确的检测诊断显得尤为重要。反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术作为一种分子生物学检测方法,因其具有较高的灵敏度和特异性,目前已成为生物检测中广泛使用的一种方法。另外RT-PCR技术容易与其他高灵敏度的检测方法相结合,如电化学发光检测技术,激光诱导荧光检测技术,毛细管电泳检测技术等,可以大大提高其检测灵敏度。
传统的PCR热循环系统和反应体系通常具有较大的热容,因而升温和降温速率低,热循环时间长(通常20～40个PCR循环大约需要1～3 h),能量消耗高,且占有较大的体积,这些不利于发展便携式的装置。为了克服传统PCR装置固有的缺点,实现快速的PCR扩增,上世纪90年代初一些研究者们就开展了基于微流体的PCR生物微流控技术的研究。微流控振荡流PCR既具有静态反应池式的微流控PCR的优点(可以反应循环数可以根据实验条件而调整),又具有连续流动PCR加热/降温速度快的优点。同时,在振荡流PCR可以在多个平行通道中实现高通量的PCR扩增。
本实验建立了一种基于毛细管的振荡流反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)的微流控装置检测烟草花叶病毒(TMV)的新方法。根据TMV移动蛋白基因设计一对PCR引物,对粗提纯的TMV颗粒直接进行RT-PCR。用0.025％小牛血清蛋白(BSA)对反应毛细管内壁进行静力学和动力学钝化,提高了PCR效率。在此微流控装置上进行RT-PCR,流速为70μL/min时,检出限为0.01μg cDNA:可以在17 min内成功扩增出179 bp的目的DNA片段。
近年来,食品安全问题越来越受到人们的重视。在早期对食品进行快速有效的检测,可以减少感染致病菌的食品进入食品工业和流通,防止食源性传染病的的传播。本文利用实验室搭建的微流控PCR装置平台,结合多元PCR技术,实现对食品中的多种致病菌进行灵敏快速的检测,并且有望发展出一种经济适用,便携式的食品致病菌检测装置。