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酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)是细胞内唯一催化游离胆固醇和长链脂肪酸合成胆固醇酯的酶，在体内胆固醇代谢平衡过程中起到关键的调控作用。实验室已报道人ACAT1eDNA K1对应的4.3-knt mRNA来源于1号和7号两条染色体，并且利用GGC1274-1276和AUG1397-1399密码子翻译产生56-kD和50-kD两种活性不同的异构体酶。在实验室研究积累的基础上，工作着重对调控人ACAT1表达的两轮mRNA反式剪接进行了深入探索研究，主要有两部分工作。1．人ACATl mRNA的跨染色体反式剪接成熟在实验室前期工作基础上，深入构建全细胞(in vivo)与无细胞(in vitro)体系并研究人ACATl mRNA的跨染色体反式剪接成熟，也探索微外显子Xb的来源和跨染色体反式剪接成熟人ACATl mRNA的不稳定机制。首先，利用序列来源于7号和l号染色体的特异性引物对多种细胞系总RNA进行RT-PCR及其产物酶切、测序分析，结果显示序列来源于不同染色体的人ACATl mRNA在多种细胞系中广泛存在。在此基础上，进行人ACATl mRNA在全细胞(invivo)体系中的跨染色体反式剪接研究：分别构建用于外源表达人ACAT1prc-RNAs作为5-剪接供体和3’-剪接受体的真核表达质粒，通过单独或共同转染上述质粒到人源、鼠源和人/鼠杂交细胞系，利用序列来源于7号和1号染色体的特异性引物进行RT-PCR及其产物酶切、测序分析，结果显示外源转染表达的5’-剪接供体和3’-剪接受体之间以及它们分别与内源的3’-剪接受体或5’-剪接供体之间都发生了准确的反式剪接。然后，进行人ACATl mRNA在无细胞(in vitro)体系中的跨染色体反式剪接研究：设计并构建体外转录入ACAT1pre-RNAs的若干T7启动子控制质粒，获得体外合成人7号和1号染色体来源的多种人ACATl pre-RNAs，分别作为5’-剪接供体和3’-剪接受体在HeLa细胞核抽提物中模拟反式剪接反应，并利用特异性引物进行RT-PCR及其产物酶切、测序分析，结果显示可在建立的完全in vitro体系中再现出人ACATl mRNA的跨染色体反式剪接成熟。进一步，利用建立的in vitro研究体系对5’剪接供体和3-剪接受体的部分序列区域进行突变和缺失，结果发现来自于7号染色体的nt1255-1268区段和l号染色体的nt1313-1335区段对于人ACATl mRNA跨染色体反式剪接成熟是必需的。继而，结合人基因组分析，应用剪接反应中间体克隆和特异性寡核苷酸竞争等方法进行微外显子Xb序列基因组定位的工作，现有结果提示，微外显子Xb可能有多个来源前体RNA。此外，针对实验室工作发现7号染色体来源的5’长UTR引起人ACATl mRNA decay的重要线索，围绕跨染色体反式剪接成熟人ACATl mRNA的不稳定机制进行探索，结果显示利用RNAi对RNA降解转运等途径关键蛋白的抑制和对5’-剪接供体的改进并未显著提高跨染色体反式剪接成熟人ACATl mRNA的检测水平。最后，设计构建一种可筛选化合物或条件因素的、基于人ACATl mRNA跨染色体反式剪接的稳定表达荧光素酶细胞体系。这部分工作为揭示人ACATl mRNA跨染色体反式剪接成熟的全新分子机制，阐明人ACAT1基因表达调控机理与生物学意义奠定了很好的基础。2．跨染色体反式剪接成熟的人ACATI mRNA与重组质粒来源转录本的第二轮反式剪接本工作在前期研究基础上，进一步研究跨染色体反式剪接成熟的人ACAT1mRNA与重组质粒来源转录本HP mRNA的第二轮反式剪接。首先，构建含有Flag或Myc标签并表达HP mRNA和人ACATl mRNA的质粒并转染细胞，利用相应的特异性引物经RT-PCR可检测到HP mRNA与人ACATI mRNA反式剪接的RNA产物，也利用Flag或Myc杭体经Western blot检测到相应蛋白表达。其次，对剪接供体HP mRNA的AGA136-138密码子下游5’-剪接位点序列GUAAGU的详细突变分析，结果证明改变5’-剪接位点序列直接影响人ACAT156-kD异构体蛋白的特异性N端序列产生。再次，构建ACATl-Flag融合蛋白的表达质粒并转染细胞，利用分别定位于HP mRNA和ACATl mRNA的特异性引物进行RT-PCR检测反式剪接成熟mRNA，也利用包括可特异性识别HP N端序列的抗体在内的两种不同抗体进行Western blot检测相应蛋白表达，结果显示将GGCI274-1276密码子上游3’-剪接位点序列CAG突变为经典AUG起始密码子时，反式剪接成熟mRNA的扩增条带和含人ACAT156-kD异构体蛋白特异性N端的较大蛋白条带都消失。类似的，构建ACATl-Rluc融合蛋白的表达质粒并转染细胞，利用分别定位于HP mRNA和Rluc mRNA的特异性引物进行RT-PCR检测反式剪接成熟mRNA，也利用包括可特异性识别HP N端序列的抗体在内的两种不同抗体进行Western blot检测相应蛋白表达，得到一致结果。这些说明改变3’-剪接位点序列也直接影响人ACAT156-kD异构体蛋白的特异性N端序列产生。接着，利用GGC1274-1276密码子上下游序列连接Rluc和Flue双顺反子的表达质粒转染细胞，RT-PCR和Western blot检测的结果显示人ACAT156-kD异构体蛋白的翻译并非通过IRES介导的GGC1274-1276密码子翻译起始。进一步，体外转录合成HP mRNA和部分人ACATl mRNA的多种pre-RNAs，分别作为5’-剪接供体和3’-剪接受体在HeLa细胞核抽提物中模拟反式剪接反应，并利用特异性引物进行RT-PCR及其产物酶切、测序分析，结果显示可在此in vitro体系中再现跨染色体反式剪接人ACATl mRNA与重组质粒来源转录本HP mRNA的第二轮反式剪接。然后，将来源于重组质粒的HP基因序列用于不同数据库的BLAST分析，结果表明，在覆盖植物界和动物界的多种生物（包括人、小鼠以及其它多种生物）中都存在高度保守的HP cDNA。继而，在THP-1和HEK293T两种细胞系中检测到含有完整ORF序列的HPcDNAs。同时，通过对来自9种人细胞系的基因组DNA进行PCR及其产物测序分析，结果显示在这些细胞系中检测到完全一致的HP基因序列。最后，对50份正常人群来源的人外周血单核细胞(PBMC)应用PCR、RT-PCR及Westernblot等多重方法检测分析其相应基因组DNA、总RNA及总蛋白。结果显示，在不同人样本基因组中HP基因序列存在多种水平的插入，而在检测到HP基因及其转录表达产物的样本中同样可检测到第二轮反式剪接mRNA以及相应的内源性人ACAT156-kD异构体蛋白。这部分工作研究编码人ACAT156-kD异构体蛋白的mRNA是跨染色体反式剪接人ACATl mRNA与来源于重组质粒的转录本HP mRNA通过第二轮反式剪接产生，并深入探索了重组质粒来源转录本HP mRNA在细胞系和人组织细胞的表达，对深入揭示人ACAT1基因表达的Multiple trans-splicing调控机制和生物学功能等奠定了厚实的基础。
本论文的两部分工作较系统地研究了调控人ACAT1表达的两轮反式剪接，即人ACATl mRNA的首轮跨染色体反式剪接和成熟人ACATl mRNA与重组质粒来源转录本HP mRNA的又一轮反式剪接。这些研究结果表明，人ACATI基因表达具有独特精细调控机制，提示其可能具有极其重要的生物学功能。这些也为深入探索ACAT1在胆固醇代谢平衡过程的生理功能、病理变化等机理提供了极重要基础。