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成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)是由人类T细胞白血病1型病毒(human T-cell leukemia virus type1，HTLV-1)感染引起的恶性淋巴系统增殖性疾病。在HTLV-1致白血病过程中，HTLV-1编码的病毒蛋白Tax能激活NF-κB信号通路，从而促进肿瘤的发生和维持。然而在ATL发展后期，Tax因表观遗传或非表观遗传方式失去表达，但NF-κB信号通路仍持续激活。说明ATL细胞中存在其它机制维持NF-κB信号通路的激活。研究表明组蛋白甲基转移酶(enhancer of zeste homolog2，EZH2)在多种肿瘤中高表达，且有研究报道显示以EZH2为核心组件的多梳抑制复合物参与调控NF-κB信号通路。在预实验中发现EZH2基因在ATL细胞中高表达。因此，猜测在ATL细胞中EZH2是否参与维持NF-κB信号通路的活力，从而促进白血病的发生呢？ 为了探究EZH2调控NF-κB信号通路及其分子机制，本研究从细胞及分子水平展开。具体内容如下: 第一部分:EZH2在ATL中高表达 首先，通过qRT-PCR技术检测5种HTLV-1阳性细胞株和2种HTLV-1阴性细胞株中EZH2基因的表达。实验发现HTLV-1阳性细胞株中EZH2基因呈现异常高表达。随后蛋白质免疫印迹实验同样发现HTLV-1阳性细胞株中EZH2蛋白表达明显高于阴性细胞株。 第二部分:HTLV-1编码的蛋白Tax促进EZH2的表达 为了解释EZH2在HTLV-1阳性细胞株中高表达的机制，首先运用双荧光素酶报告基因实验检测HTLV-1病毒基因组对EZH2启动子的影响。实验发现HTLV-1感染性克隆能激活EZH2基因启动子活力。随后发现HTLV-1编码的病毒蛋白Tax能激活EZH2启动子活力，而HTLV-1编码的另一个关键致癌蛋白HBZ则无激活活性。为了验证上述结果，通过蛋白质免疫印迹实验发现，过表达Tax基因后，细胞内EZH2蛋白的表达显著上调。然而病毒蛋白HBZ却不能促进EZH2蛋白表达。同时qRT-PCR实验也证实HBZ对EZH2基因的表达无影响。 第三部分:EZH2促进Tax和p65介导的NF-κB信号通路 为了探索EZH2与NF-κB信号通路的关系，首先通过报告基因实验检测EZH2对PMA/Ionomycin和Tax介导的NF-κB信号通路的影响。实验结果显示EZH2不能单独激活NF-κB信号通路，但能促进PMA/Ionomycin和Tax介导的NF-κB信号通路。前期研究发现Tax在ATL细胞内激活两条NF-κB信号通路，即经典和非经典NF-κB传导途径。为了探究EZH2是否能同时激活两条NF-κB通路，分别检测了EZH2对p65介导的经典途径和p52介导的非经典途径的影响。报告基因结果显示，EZH2对p52介导的非经典信号通路没有作用，但能促进p65介导的经典信号通路。为了解释EZH2促进NF-κB信号通路的分子机制。运用免疫共沉淀实验检测EZH2与Tax和p65蛋白之间的互作情况。实验结果显示EZH2能与Tax蛋白结合。说明EZH2通过与Tax结合促进Tax介导的NF-κB信号通路。EZH2与Tax突变体实验分析表明，当删除Tax序列中能激活NF-κB信号通路的片段后，EZH2与Tax突变体的结合减弱。进一步研究发现，EZH2同样能与NF-κB信号通路的核心蛋白p65结合。突变体实验分析表明，EZH2可以与p65突变体(1-320)结合，但与p65突变体(313-551)不结合。说明EZH2只能与p65的Rel同源结构域结合。 第四部分:EZH2以组蛋白甲基转移酶非依赖方式促进NF-κB信号通路 文献报道EZH2主要功能是通过其SET结构域的组蛋白甲基转移酶活力沉默基因表达，从而调控肿瘤的发生。但越来越多的研究证明，EZH2可以不依赖组蛋白甲基转移酶活力在多种肿瘤中起作用。为了研究在ATL细胞中，EZH2是否同样以组蛋白甲基转移酶依赖的方式促进NF-κB信号通路的激活？首先利用报告基因实验检测EZH2缺失SET结构域对Tax和p65介导的NF-κB信号通路的影响。结果显示缺失SET的EZH2突变体仍然具有激活Tax和p65介导的NF-κB信号通路的功能。同时，免疫共沉淀实验证明EZH2与Tax和p65的结合同样不依赖EZH2的SET结构域。此外，检测发现EZH2可以促进p65的入核，且该作用不依赖SET结构域。 综上所述，通过本研究发现，在ATL细胞中EZH2高表达，HTLV-1编码的病毒蛋白Tax促进了EZH2的表达。EZH2通过与Tax或p65蛋白的结合促进NF-κB信号通路。同时研究证明EZH2能组蛋白甲基转移酶非依赖方式促进p65入核，进而激活NF-κB信号通路。本研究为阐明NF-κB信号通路在ATL细胞中持续激活的分子机制提供新的思路，同时为以EZH2为靶点治疗ATL提供新的策略和靶点。