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目的：以鼠抗人纤维蛋白D-二聚体单克隆抗体(anti-D-dimer mouse monoclonalantibody,DDmAb)为靶向装置,制备溶栓剂尿激酶(urokinase,UK)的血栓靶向脂质体即尿激酶免疫脂质体(urokinase-loadcd immunoliposomes,Ab-Lip-UK),并在兔急性肺动脉栓塞模型上观察其早期溶栓效果.
背景：肺动脉栓塞(pulmonary embolism，PE)已成为严重危害患者健康和生命质量的国际性重大医疗保健问题.近年来虽然人们对PE的诊治水平有一定的提高,但伴随血流动力学障碍的急性PE患者病死率仍很高.国外文献报道急性PE的病死率为23.38％,其中90％的患者在症状出现后2h内,因肺血管阻力的增加引起急性右心功能衰竭而死亡.溶栓疗法能迅速溶解血栓,改善血流动力学,从而减少肺动脉高压的发生和降低病死率,是治疗PE最直接有效的方法.但临床常用的溶栓剂缺乏组织特异性,不能选择性地作用于病变部位,易引发出血等问题.因此将溶栓药物导向血栓部位,增加血栓局部药物浓度,从而特异、局部、高效地溶解血栓已成为溶栓治疗的一个研究热点.脂质体作为药物载体有它独特的优点,但因其缺乏主动靶向性,易被网状内皮系统(reticuloendothelial system,RES)从循环中清除,而不易达到病变部位.为了克服脂质体的这些缺点,可在脂质体的表面连接靶向装置,制成免疫脂质体来提高疗效.免疫脂质体是抗体修饰的脂质体的简称,它是利用抗原抗体间特异性识别机制,将抗体或抗体片断组装于脂质体表面,通过抗体分子的特异性,专一地与靶细胞表面的互补分子相互作用,使脂质体在靶区释放药物,达到靶向给药(即药物导弹)的目的,以进一步提高药效.采用此种机制制成的抗肿瘤药物已用于临床治疗.本实验采用相同机制将不同剂量的DDmAb连于脂质体表面,制成血栓靶向Ab-Lip-UK,并在兔急性肺动脉栓塞模型上观察不同的抗体剂量的Ab-Lip-UK的早期溶栓效果,同时用免疫组织化学染色的方法检测DDmAb的靶向性.
第一部分:兔急性肺动脉栓塞模型的建立
材料与方法：
1.栓子制作:无菌条件下从兔左侧颈静脉取血2ml置于玻璃皿中,静置1h使其凝固,制成直径为2mm、长为5mm的长柱形栓子,灭菌生理盐水反复冲洗,选4个栓子备用.
2.兔急性肺动脉栓塞模型的建立:新西兰大白兔25只(首都医科大学动物部提供),随机分为插管组8只,生理盐水组8只,栓塞组9只.栓塞组兔采用自体血栓栓子右心室插管注入法建立急性肺动脉栓塞模型,右心室收缩压(right ventricular systolic pressure,RVSP)升高并稳定维持1h证明模型建立成功.插管组兔插管成功后不做任何处理.生理盐水组兔插管成功后注入16 ml生理盐水.
结果：
栓塞组,右心室插管和栓子栓塞的成功率均为100％,兔的猝死率为11.11％.注入栓子后1h,RVSP明显上升,与注栓前比较有显著性差异(P<0.05).病理结果,肉眼观察,每只兔肺动脉腔内,均可找到注入的4个栓子,大小与注入前近似,镜下观察每只兔均有肺栓塞的病理改变.对兔进行单独右心室插管或插管后注入16ml生理盐水均不会引起RVSP及舒张压(right ventricular diastolic pressure,RVDP)的变化.
第二部分:Ab-Lip-UK体内靶向溶栓效果的检测
材料与方法：
1.溶栓药物的制备:以氢化卵磷脂、胆固醇、脑磷脂、尿激酶为原料,用反相蒸发法制备尿激酶脂质体(Lip-UK).戊二醛交联法连接Lip-UK与DDmAb,制成Ab-Lip-UK.
2.体内溶栓实验:新西兰大白兔40只(首都医科大学动物部提供),随机分为TBS组(TBS缓冲液,阴性对照组)、UK组(15万IU/kg UK,阳性对照组)、Lip组(5万IU/kg UK的Lip-UK)、Ab组(5万IU/kg UK的Ab-Lip-UK)和2Ab组(5万IU/kg UK但DDmAb用量为Ab组2倍的Ab-Lip-UK,2Ab-Lip-UK)共5组,每组8只.各组成功建立急性肺动脉栓塞模型后5 min分别以TBS缓冲液、UK、Lip-UK、Ab-Lip-UK和2Ab-Lip-UK各30ml经股静脉输入进行体内溶栓实验,观察右心室压力在1 h内随时间变化的情况.实验结束后,处死动物并取材,观察肺动脉内残留栓子数及心、肝、肾的肉眼和组织学变化.
3.DDmAb靶向性的检测:以制备 Ab-Lip-UK的鼠抗人D二聚体(D-dimer,DD)单克隆抗体为一抗做免疫组织化学染色,观察栓子中DD的表达,以检测DDmAb的主动靶向性.
结果：
1.脂质体:用反相蒸发法和交联法可制备出Ab-Lip-UK.透射电镜下观察,Ab-Lip-UK呈葡萄串样,圆形或椭圆形,大小较一致,直径为:44.45±16.54nm.
2.体内溶栓实验:TBS组RVSP在溶栓后1h内无显著性变化,UK组、Lip组、Ab组、2Ab组RVSP分别于溶栓后30 min、40 min、30 min、20 min后显著下降.TBS、UK、Lip-UK、Ab、2Ab各组肺内残留栓子数分别为:4±0,2.4±0.92,3.1±0.64,2.4±0.92,1.9±0.64个.各组肺均有不同程度的淤血、水肿表现.HE染色除UK组心、肝、肾有出血外,其余组未见出血.
3.免疫组织化学染色:肺动脉栓子中可见棕黄色阳性着色,表明栓子内存在DD成份,同时也证明了DDmAb的主动靶向性.
结论：
用反相蒸发法与交联法可制备出尿激酶免疫脂质体.Ab组与UK组溶栓效果相似,但前者尿激酶用量仅为后者的1/3,且无出血副作用.2Ab组抗体剂量较Ab组增加1倍,但可使RVSP提前10 min下降,且溶解的栓子个数增加,并也无出血发生.免疫组化结果表明DDmAb具有很好的血栓靶向作用,可作为肺动脉栓塞溶栓治疗的靶向装置.以2Ab-Lip-UK 这种具有双重靶向作用的药物进行溶栓治疗是PE的一种理想溶栓方式,可缩短有效溶栓时间,疗效好且安全.