蚓激酶提取工艺以及酶学性质研究

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蚓激酶(Earthworm fibrinolytic enzymes,EFE)是一组具有激酶和纤溶酶活性的丝氨酸蛋白水解酶,可以作为治疗血栓类疾病的药物。本论文利用赤子爱胜蚓(Eisenia faetida)为原料,采用超滤、硫酸铵盐析,以及分子筛和离子交换层析等手段,对蚓激酶的提取工艺进行优化研究,并对提取工艺的成本进行核算。在获得了较高纯度的蚓激酶(EFE)的基础上,本论文也蚓激酶的其酶学特性展开初步研究。其主要实验结果如下:   1)蚓激酶的提取工艺的优化   以赤子爱胜蚓(Eisenia faetida)为原料,采用组织破碎、离心、超滤、二次硫酸铵盐析、Sephadex G-25凝胶过滤、DEAE-Cellucose-52离子交换层析的提纯步骤,分离得到蚓激酶(EFE)。酶活力检测采用纤维蛋白平板法,实验过程中对酶提取条件进行优化,选取0.1 mol/L pH7.8的磷酸缓冲溶液作为提取缓冲液,在盐析过程中分别选取35%-70% NH4SO4分部沉淀。提取纯化的蚓激酶(EFE)经过DEAE离子交换层析,比酶活达42000 U/mg,纯化倍数达到53.8倍,酶活力回收率为3.7%。经过SDS-PAGE凝胶电泳,其相对分子量约为26 kD,含有2个亚基,每个亚基的相对分子量约为14 kD;获得二聚体,得到较高纯度的蚓激酶。   2)提取工艺的成本核算   本实验提取纯化的蚓激酶过程中能耗、成本支出、蚓激酶收益进行成本核算,以15000U/mg规格蚓激酶市场价6000元/kg,20000U/mg规格蚓激酶市场价12000元/kg为标准,100 kg鲜蚯蚓可生产规格为15000U/mg的蚓激酶4.2kg或者规格为20000U/mg的蚓激酶2.46kg,经过成本计算得到毛利润分别为19962.7元和24282.7元。   3)以提取的蚓激酶为研究对象,对蚓激酶(EFE)的酶学性质和酶的稳定性进行了研究。来源于赤子爱胜蚓(Eisenia faetida)的蚓激酶最适温度为45℃,最适pH为7.0;在37-55℃,该酶有较好的热稳定性,但是温度高于60℃时,酶活迅速降低;在pH 7.0-9.0范围内,酶活相对稳定,说明该酶有一定的耐碱性;金属离子Hg2+对酶活有强烈的抑制作用;而Mg2+对酶有明显的激活作用;Ca2+和K+对酶活的影响不明显算。
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